[发明专利]一种“金蚕花”抗癌活性核苷类化合物JCHN2的制备方法

权利要求书

1.一种“金蚕花”抗癌活性核苷类化合物JCHN2的制备方法，其特征在于：

1)将蝉拟青霉ST168感染家蚕蛹，培育出“金蚕花”；

2)将“金蚕花”处理获得“金蚕花”粉；

3)取“金蚕花”粉加入乙醇溶液并进行超声处理；

4)超声处理后的溶液依次进行水浴回流和抽滤处理，然后离心处理收集上清液；

5)上清液浓缩后冷冻干燥，得到粗核苷类化合物；

6)用双蒸馏水将粗核苷类化合物溶解，离心取上清液后，过滤膜再上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱吸附处理；

7)用乙醇溶液洗脱后收集洗脱峰的洗脱液，浓缩并冷冻干燥后得到核苷类化合物干燥物；

8)用双蒸馏水将核苷类化合物干燥物溶解，离心取上清液后，过滤膜再上SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱，用NaCl水溶液进行梯度洗脱，收集0.3mol/L NaCl洗脱峰的洗脱液；

9)洗脱液浓缩并冷冻干燥，用双蒸馏水溶解，过滤膜再上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱脱盐；

10)用乙醇溶液洗脱后收集洗脱峰的洗脱液，冷冻干燥后得到均一的核苷类化合物，取名JCHN2。

2.根据权利要求1所述的一种“金蚕花”抗癌活性核苷类化合物JCHN2的制备方法，其特征在于方法的工艺条件具体为：

1)从天目山采集的野生蝉花体中分离出蝉拟青霉ST168，在马铃薯琼脂培养基上于26℃下培养7天，用0.05％吐温80水溶液洗下分生孢子并配成2-3×10⁸个/mL分生孢子悬液；将分生孢子悬液均匀喷湿化蛹第2天的蚕蛹体表，然后至28℃下培养，待蛹体僵硬后，埋入3-4cm深土中，继续28℃下培养，待子座长出土面后收获，得到“金蚕花”；

2)将“金蚕花”于-50℃下真空干燥36h，于-15℃下超微粉碎5min，过80～100目筛，得到“金蚕花”粉；

3)取“金蚕花”粉，加入乙醇溶液，混匀后，在30℃下用超声波清洗仪以500W功率53KHz频率的超声波磁场作用30min；

4)于100℃水浴中回流提取3次，共2.1h，集中收集三次的提取液，三次提取液经过合并后用抽滤机进行抽滤处理，弃掉滤渣，将滤液用高速离心机于10000rpm下离心5min，弃掉沉淀，收集上清液；

5)上清液用旋转蒸发仪浓缩后，-50℃下真空干燥，得到粗核苷类化合物；

6)用双蒸馏水溶解粗核苷类化合物并调整质量浓度为5.0～6.0mg/mL，将溶液在8000rpm下离心10min，取上清液，过0.45mm滤膜，上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱吸附，用5倍柱体积的去离子水充分冲洗；

7)用质量分数为75％的乙醇溶液于2.0～3.0mL/min流速下洗脱，自动收集器收集，用紫外分光光度计于254nm波长测定，收集合并具有核苷类化合物洗脱峰的洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩后，-50℃下真空干燥，得到核苷类化合物干燥物；

8)用双蒸馏水溶解核苷类化合物干燥物并调整质量浓度为2.0～2.5mg/mL，将溶液在8000rpm下离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，上SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱，用0-0.5mol/L浓度梯度的NaCl水溶液进行梯度洗脱，洗脱流速为1.0-1.3mL/min，收集0.3mol/L浓度的NaCl水溶液对应洗脱峰的洗脱液；

9)洗脱液用旋转蒸发仪浓缩后，-50℃下真空干燥，用双蒸馏水溶解干燥物并调整质量浓度为2.5～3.0mg/mL，将溶液在8000rpm下离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱吸附，用5倍柱体积的去离子水充分冲洗；

10)用质量分数为75％的乙醇溶液于2.0～3.0mL/min流速下洗脱，自动收集器收集，用紫外分光光度计于254nm波长测定，收集合并具有核苷类化合物洗脱峰的洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩后，-50℃下真空干燥，得到均一的核苷类化合物，取名JCHN2。

3.根据权利要求1所述的一种“金蚕花”抗癌活性核苷类化合物JCHN2的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，按W：V为1:40配比加入“金蚕花”粉和质量分数为80％的乙醇溶液。