[发明专利]一种提高细胞抗体表达量的方法

说明书

本发明公开了一种提高动物细胞抗体表达量的方法。该方法包括以下步骤：(1)设计gRNA，具体序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；(2)将退火后的gRNA与质粒连接，并对连接后的质粒进行克隆保存；(3)采用步骤(2)所得质粒进行病毒包装，然后再对细胞进行病毒转染，培养5～7天后，筛选得到TRIM21蛋白敲除的单克隆细胞株，最后得到TRIM21蛋白敲除的细胞系。本发明通过敲除细胞内的TRIM21蛋白，可将细胞抗体表达量提高达20％‑50％，并且，在提高抗体表达量的同时不会影响抗体的质量，还能降低抗体的生产成本，缓解抗体市场的供需平衡。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种提高细胞抗体表达量的方法。

背景技术

抗体是指机体在抗原性物质刺激下，由B细胞分化成浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。抗体针对相应抗原具有高特异性和高亲和力的特性，使得其在生物医学领域、疾病诊断和疾病治疗中有着无可比拟的优势。传统生产抗体的方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，这种抗体称为多克隆抗体，即第一代抗体。80年代中期，随着DNA重组技术的发展以及人们对Ig分子认识的深入，抗体由单克隆抗体即第二代抗体发展到了第三代抗体：基因工程抗体。

基因工程抗体可以在多种体系成功表达，包括哺乳细胞、大肠杆菌、酵母细胞、转基因动植物等表达体系。然而因为哺乳细胞具有低免疫原性和且其细胞器可以提供最优的折叠、分泌和翻译后修饰的特点，使其成为治疗性抗体的首先细胞。但由于其生产成本高，构建周期长，基因操作困难，尤其是库存体积小导致生产的抗体量有限。近年来随着新的分子生物学技术、细胞工程及载体工程技术的快速发展，加之发酵技术的改进，这些都使抗体的表达量得到了提高。

到目前为止，提高抗体表达量的方法多为促进细胞株的代谢工程改造，并加强对细胞培养过程的理解和优化，提高抗体表达速率，开发高产量、高质量的细胞培养工艺。但是，无论是通过细胞工程或优化细胞培养来提高抗体表达量，其效率和产量都是有限的，而且并不是所有的蛋白都能在宿主细胞中获得很好的表达，加之人们对真核细胞表达调控机制认识不够充分造成抗体难于大规模化生产；另外，细胞工程技术生产的抗体成本极其昂贵(US$200/100mg)。由于基因工程抗体不易大规模化生产和高昂的生产成本从而制约了其临床应用。因此，亟需一种既能提高抗体表达量又不影响抗体安全性、特异性和纯度且能降低抗体生产成本的方法。

而TRIM蛋白(Tripartite motif family proteins)家族参与一系列的细胞生物学过程，人源TRIM约70多种。其中人源TRIM21蛋白的分子量为52KU,共含有475个氨基酸，由多个结构域组成。其中包含一个RING结构域、一个B-box结构域、一个coil-coil结构域以及C末端的B30.2结构域等。RING-Finger结构域是TRIM21作为泛素连接酶参与细胞代谢的基础,而其B30.2结构域能与IgG Fc段CH2-CH3结构域特异性结合。Clift D等人运用TRIM21蛋白的以上特性发明了Trim-away的方法，该方法是利用抗靶蛋白的IgG抗体靶向目标蛋白，再利用TRIM21靶向该IgG，从而特异性的敲除目的蛋白。然而目前未见关于通过敲除TRIM21来提高细胞抗体表达量的相关内容。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种提高细胞抗体表达量的方法，通过敲除细胞内TRIM21蛋白，能显著提高细胞抗体的表达量。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种提高细胞抗体表达量的方法，包括以下步骤：

(1)设计gRNA，具体序列如下：

gRNA-F：CACCGCAATCGACAGCTAGCCAACA；

gRNA-R：AAACTGTTGGCTAGCTGTCGATTGC；