[发明专利]黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法

权利要求书

1.一种黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法，其特征在于，包含如下步骤进行：

1)提取黔北麻羊卵巢组织的RNA，经逆转录获得黔北麻羊卵巢组织的cDNA，将cDNA经PCR扩增获得TIMP1基因的CDS区序列，将扩增后产物胶回收与pMD19-T载体连接，转化进入TOP10感受态细胞进行培养，蓝白斑筛选，选取白色菌落经LB液体培养基扩培，PCR检测验证，质粒提取测序验证；回收重组质粒和pEGFP-N3载体的双酶切的目的片段进行连接，获得pEGFP-N3(+)-TIMP1重组载体；

2)用1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，切胶回收目的条带和pMD19-T载体连接；连接体系：pMD19-T载体1ul，目的片段5ul，buffer 1ul，T4DNA连接酶1ul，ddH2O 1ul；将反应混合物在16℃金属浴连接过夜；将反应产物连接到100ul感受态细胞中，培养后选取白色单菌落分别加入盛有AMP抗性的LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养12h～16h PCR检测菌液阳性克隆，提取重组质粒测序验证；

3)双酶切体系如下：重组质粒、pEGFP-N3(+)空载体各8ul，EcoR Ⅰ 2ul，BamH Ⅰ 2ul，10×QuickCut Green Buffer 2ul，ddH₂O补足20ul，37℃恒温水浴锅中酶切3h，用1.5％的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳检测，切胶回收目的条带和pEGFP-N3(+)空载体；连接体系：pEGFP-N3(+)空载体10ul，目的片段2ul，buffer 1.5ul，T4 DNA连接酶1.5ul；将反应混合物在16℃金属浴连接过夜；将反应产物连接到100ul感受态细胞中，培养后选取白色单菌落分别加入盛有5ul卡钠抗性的LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养12h～16h菌液检测阳性克隆，提取重组质粒，双酶切鉴定，阳性克隆。

2.根据权利要求1所述的黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法，其特征在于：所述的引物包括上游引物EcoR Ⅰ和下游引物BamH Ⅰ，其中上游引物EcoR Ⅰ F的序列单下划线部分为保护碱基，双下划线部分为酶切位点；下游引物BamH Ⅰ R的序列：单下划线部分为保护碱基，双下划线部分为酶切位点。

3.根据权利要求1所述的黔北麻羊TIMP1基因真核表达载体的构建方法，其特征在于：所述的PCR反应体系为：所述的PCR扩增的反应总体系20ul:上、下游引物各1.0μL，模板cDNA1.0μL，2×Es Taq MasterMix 10μL，ddH2O 7μL，PCR的反应条件为：95℃预变性5min；{95℃变性30s，56.6℃退火15s，72℃延伸30s}×35个循环；72℃终延伸5min，4℃保存。