[发明专利]DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数的测定方法

说明书

本发明涉及一种DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数的测定方法，该方法包括以下步骤：提供待补平模板和底物，待补平模板包括模板链和与部分模板链配对结合的引物链；将包括不同浓度的第二标记的核苷酸的底物分别与待补平模板和足量的DNA聚合酶混合，以进行延伸反应，并采用停流光谱法检测各延伸反应的荧光强度变化，得到多个荧光强度变化速度；及根据荧光强度变化速度及对应的第二标记的核苷酸的浓度，得到DNA聚合酶的动力学参数。上述方法测定DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数准确性更高。

技术领域

本发明涉及DNA聚合酶，特别是涉及一种DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数的测定方法。

背景技术

DNA聚合酶(DNA polymerase)是细胞复制DNA中的重要作用酶，广泛存在与几乎所有的生物中。DNA聚合酶能利用DNA或者RNA为模板，dNTP为底物，完成一条核酸链的复制。自然条件下，DNA聚合酶以及其他的蛋白分子共同协作，参与了细胞分裂和基因组复制的过程，在维持遗传物质完整性方面发挥着重要作用。

DNA聚合酶因其种类、来源、结构和功能的多样性，使得从1959年第一个DNA聚合酶的发现至今，DNA聚合酶的研究从未中止过。研究表明，DNA聚合酶家族拥有众多成员，根据蛋白序列保守性和二级结构特征分析，可以将DNA聚合酶分为A、B、C、D、X、Y和逆转录酶(RT)七个亚家族。近年来，DNA聚合酶广泛应用于生物技术和科学研究领域的各个方面，包括cDNA合成，DNA末端修饰和DNA测序等。

传统的检测DNA聚合酶活性的方法有放射性同位素法、PCR法及荧光染料掺入法。放射性同位素法是通过DNA聚合酶催化的32P标记的dNTP掺入到小牛胸腺DNA中，经过TCA沉淀、whatman滤纸过滤，通过测定酸不溶性物质中放射性的含量，从而计算聚合酶活性。放射性同位素法方法易产生放射性污染、操作繁琐，难以实现高通量的检测。

PCR法是使用5‘端有cy5荧光标记的引物进行PCR，在不同的时间内加入等体积的终止液终止反应，终止液中含有竞争性寡聚核苷酸，可阻止荧光产物与模板的重结合。随后使用含8M尿素的聚丙烯酰胺进行电泳验证结果。

荧光染料掺入法是通过在PCR反应体系中掺入荧光染料，反应体系的荧光的强度会随着反应的进行逐渐提高，通过实时荧光定量PCR仪给出的图像可得到反应的初始速率，加入酶的浓度不同，初始速率也会不同，根据这一特点可以用已知酶活的聚合酶绘制标准曲线，将未知聚合酶反应的初始速率带入标准曲线，即可得到该未知聚合酶的酶活。

虽然PCR法和荧光染料掺入法的检测DNA聚合酶活性能够避免放射性污染，但是PCR法和荧光染料掺入法都是检测的DNA聚合酶在稳态条件下的动力学参数，评价的都是DNA聚合酶在稳态条件下的酶活性。对于DNA聚合酶在前稳态条件下催化反应的动力学参数还无法检测，还无法评价是DNA聚合酶在前稳态条件下的酶活性。

发明内容

基于此，有必要提供一种检测DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数的测定方法。

一种DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数的测定方法，包括以下步骤：

提供待补平模板和底物，所述待补平模板包括模板链和与部分所述模板链配对结合的引物链，所述待补平模板具有第一标记，所述底物包括具有第二标记的核苷酸，所述第二标记与所述第一标记能够发生荧光共振能量转移，所述模板链未与所述引物链配对结合的核苷酸中只有一个能与所述具有第二标记的核苷酸互补配对；

将包括不同浓度的所述第二标记的核苷酸的底物分别与所述待补平模板和足量的DNA聚合酶混合，以进行不同浓度的所述第二标记的核苷酸的所述引物链的延伸反应，并采用停流光谱法检测各所述延伸反应的荧光强度变化，得到多个荧光强度变化速度；及

根据多个所述荧光强度变化速度及对应的所述第二标记的核苷酸的浓度，得到所述DNA聚合酶的前稳态酶促反应动力学参数。