[发明专利]利用CRISPR/Cas9敲除文库技术筛选JEV抗性基因的方法与靶点

说明书

本发明提供了利用CRISPR/Cas9敲除文库技术筛选JEV抗性基因的方法与靶点。具体地，本发明提供了一种基于全基因组CRISPR/Cas9敲除文库策略，筛选JEV抗性相关基因的方法及候选靶基因。本发明方法先利用一个包含有针对猪全基因组的sgRNA质粒库包装慢病毒，感染Cas9稳定表达的猪体细胞，通过流式细胞术富集获得全基因组基因敲除细胞库。再利用JEV感染敲除细胞库，收集存活细胞，提取基因组DNA并进行PCR扩增，建库和高通量测序，最后利用生物信息学分析获得数十个JEV抗性候选功能基因。本发明建立了基于全基因CRISPR/Cas9敲除文库策略筛选猪的JEV抗病基因的方法，所鉴定的候选基因靶点可用于抑制JEV复制的靶向药物开发与抗病育种研究。

技术领域

本发明涉及动物抗病育种领域，具体地涉及利用CRISPR/Cas9敲除文库技术筛选JEV抗性基因的方法与靶点。

背景技术

动物疾病不仅危害畜牧产业，同样危害着人类健康。如SARS、禽流感和乙型脑炎等人畜共患病，对动物和人类都是一种极大的威胁。如何控制病原微生物感染与传播是近年来一直被关注的热点问题。

对于已经有预防性疫苗的传染病，给易感猪群接种疫苗是最为保险的方法。但有些病毒变异快，疫苗防控困难。从遗传上提高畜禽本身的抗病能力从而改善畜禽的健康和畜产品的安全，是当前动物遗传育种学者亟须解决的重大问题，也是国家重视的畜禽种业技术难题。

目前利用基因编辑抗病育种手段改造宿主基因，从而提高宿主的抗病能力，实现阻止病毒感染已有成功的案例报道。如基因编辑抗蓝耳病猪和抗结核病转基因牛。但这种方法的关键之处在于发现病原微生物感染必需的关键宿主基因。因此，如何在动物细胞中实现高通量筛选与病原微生物互作的宿主关键基因是亟需解决的核心技术问题。

流行性乙型脑炎(简称乙脑病)是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus,JEV)感染引起的一种人畜共患病，属于国家二类动物疫病。猪场中暴发猪乙型脑炎后，公猪睾丸肿大，精子可带毒通过配种传染；怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎；初生仔猪脑炎、共济失调、发热、死亡。目前该种疾病还没有特效治疗药物，发病后要及时采取措施，需将患病猪扑杀进行无害化处理。

尽管乙脑疫苗是预防流行性乙型脑炎的有效措施，但由于JEV感染机制尚不清楚，目前尚无有效的治疗药物，尤其缺乏有效分子靶点。

因此，本领域迫切需要开发新的能实现高通量筛选JEV抗性基因的方法及用于提高动物尤其是猪的流行性乙型脑炎抗病性的靶点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种全基因组无偏的高通量地筛选猪的JEV抗性基因的新颖方法。

本发明的另一目的就是提供可用于提高动物尤其是猪的流行性乙型脑炎抗病性的靶点及其应用。本发明的这些通过CRISPR文库筛选并鉴定的参与介导JEV复制的关键宿主基因，可作为乙型脑炎药物治疗或构建抵抗JEV复制细胞或动物模型的分子靶标。

在本发明的第一方面，提供了一种确定潜在的JEV抗性相关基因的方法，包括步骤：

(a)提供稳定表达Cas9并经重组病毒感染并存活的猪体细胞(较佳地为肾细胞，更佳地为PK-15-Cas9)作为第一细胞库，以及不表达Cas9的猪体细胞作为对照细胞，其中所述第一细胞库的细胞和对照细胞属于同一类型的体细胞；

其中，所述的重组病毒是可感染所述猪体细胞的病毒，并且分别用于表达靶向猪基因的不同的敲除sgRNA所构成的sgRNA集(sgRNA)，其中sgRNA集包括N种靶向不同的猪基因的重组病毒，其中N为≥1000(较佳地N≥5000，更佳地≥20,000或10,000-100,000个)的正整数；

(b)在对照组中，用日本脑炎病毒(JEV)感染所述的对照细胞；和在测试组中，用日本脑炎病毒(JEV)感染所述的第一细胞库的猪体细胞(即测试细胞)，其中对照组和测试组的实验条件是相同或本质上相同的；