[发明专利]一种基于柑橘原生质体的高效检测蛋白质亚细胞定位方法

说明书

本发明公开了一种基于柑橘原生质体高效检测蛋白质亚细胞定位方法，包括以下步骤：(1)将细胞器荧光蛋白标记载体转化农杆菌，得到重组农杆菌；(2)重组农杆菌侵染柑橘外植体，获得表达细胞器荧光蛋白标记的柑橘材料；(3)将待测基因克隆到荧光不同于步骤(1)的荧光标记表达载体，获得待测基因荧光标记载体；(4)酶解步骤(2)得到的柑橘材料，分离纯化并获得表达细胞器荧光蛋白标记的柑橘原生质体；(5)通过PEG介导，将待测基因荧光标记载体转化步骤(4)获得的柑橘原生质体，培养24‑48h后，激光共聚焦显微镜下观察，两种荧光蛋白标记重合则表明待测基因表达蛋白定位于该细胞器。本发明方法简单、便捷、高效、成本低，成功率大幅提高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于柑橘原生质体的高效检测蛋白质亚细胞定位方法。

背景技术

柑橘是世界第一大果树，也是我国南方最重要的果树。由于柑橘基因组高度杂合，遗传背景复杂，并具有童期长、多胚等特性，阻碍了柑橘基因功能研究进展。随着基因组学发展和测序技术进步，多个柑橘基因组已测序完成，鉴定了越来越多的柑橘基因。蛋白质是基因表达产物，蛋白质结构与功能同其亚细胞定位有着紧密联系，蛋白质必须处于特定位置才能发挥基因功能。因此，检测蛋白质亚细胞定位是研究基因功能的必要步骤。

早期多年生木本植物柑橘的瞬时表达体系不成熟，需要借助模式植物烟草或拟南芥的原生质体，检测柑橘蛋白质亚细胞定位。由于物种不一致，在模式植物细胞中检测柑橘蛋白质亚细胞定位不及在柑橘细胞的定位结果可靠。

现在采用的在柑橘细胞检测蛋白质亚细胞定位方法为质粒共转化法，即将细胞器荧光蛋白标记质粒和待测基因荧光标记质粒共转入柑橘原生质体，使两种质粒在细胞内共同表达，该方法在拟南芥、烟草等模式植物的原生质体成功率较高，但在多年生木本植物柑橘的成功率较低，难以获得两种质粒共转化的细胞。同时，采用传统的共转化方法，每次检测蛋白亚细胞定位均需中量抽提对应的细胞器荧光蛋白标记质粒，质粒抽提试剂耗费较大。而且，由于不同表达载体表达情况不一样，共转成功的细胞也难以观察到两种荧光完全重合。即在一种荧光蛋白表达较好的情况下，另一种荧光蛋白基因表达相对慢一些，荧光蛋白信号较弱，需要重复几次，观察更多的细胞，才能观察到荧光信号表达水平一致的细胞。由此可见，传统的检测柑橘蛋白质亚细胞定位的方法过程复杂、成功率低、费时费力、成本较高。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供了一种基于柑橘原生质体的高效检测蛋白质亚细胞定位方法，利用柑橘稳定遗传转化与瞬时转化相结合。分两步进行，利用柑橘稳定遗传转化创制稳定表达细胞器荧光蛋白标记的柑橘材料，使用获得的稳定表达细胞器荧光蛋白标记的柑橘材料分离原生质体，细胞器荧光蛋白标记已稳定表达于获得的原生质体，只需将待测基因荧光标记载体单转入前面所述原生质体瞬时表达，培养24-48h后，激光共聚焦显微镜下观察。两种荧光重合则表明待测基因表达产物定位于该细胞器。该方法仅需要瞬时转化一个质粒，即可检测柑橘蛋白质亚细胞定位，简单、便捷、高效、节约成本。同时，创制的稳定表达细胞器荧光蛋白标记的柑橘材料(愈伤组织细胞系、再生植株等)能长期保存，可以无限次的用于检测柑橘蛋白质亚细胞定位。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于柑橘原生质体的高效检测柑橘蛋白质亚细胞定位方法，包括以下步骤：

(1)将带有细胞器标记荧光蛋白(细胞器定位标签与荧光蛋白基因融合，由同一个启动子驱动表达)的细胞器荧光蛋白标记载体转化农杆菌，获得重组农杆菌；

(2)重组农杆菌侵染柑橘外植体，获得表达细胞器标记荧光蛋白的柑橘材料；

(3)将待测基因克隆至荧光不同于步骤(1)的荧光标记表达载体(待测基因与荧光蛋白基因融合，由同一个启动子驱动表达)，获得待测基因荧光标记载体；

(4)酶解步骤(2)获得的柑橘材料，分离纯化并获得表达细胞器荧光蛋白标记的柑橘原生质体；