[发明专利]柑橘线粒体InDel分子标记及其应用

权利要求书

1.一种线粒体InDel分子标记引物在鉴定柑橘属、枳属和山金柑种质中的应用，其特征在于：所述的线粒体InDel分子标记引物为下述2对引物：

ZKF：CCTCGTCGGATTCGTTCA，

ZKR：CACGGGTCATGCCTCAAT；

SJGF：GCGGTTGCACCGACTCAA，

SJGR：CTTGCTGGGCACGGTTTT；

引物对ZKF/ZKR以柑橘属的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到266bp的条带；引物对ZKF/ZKR以枳属的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到240bp的条带；引物对ZKF/ZKR以山金柑的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到266bp的条带；用引物对ZKF/ZKR将枳属与柑橘属、山金柑区分开；

引物对SJGF/SJGR以柑橘属的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到154bp的条带；引物对SJGF/SJGR以枳属的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到154bp的条带；引物对SJGF/SJGR以山金柑的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到129bp的条带；用引物对SJGF/SJGR将山金柑与柑橘属、枳属区分开。

2.一种鉴定柑橘原生质体融合后代线粒体来源的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)DNA提取：提取待鉴定柑橘原生质体融合后代及其亲本的基因组DNA；

(2)PCR扩增：以步骤(1)中提取的DNA为模板，利用能区分双亲的线粒体InDel分子标记引物中的任一对进行PCR扩增；

(3)电泳检测：用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，得到电泳图，根据样品间条带的一致性来判断待检测样品线粒体来源；

所述的能区分双亲的线粒体InDel分子标记引物为下述5对引物：

HBF：CCCGCCCTTAGGAGATTG，

HBR：TCCCTCGGACTCGGAAAG；

G1F：ACGCTTTGGTTAGGCTTGG，

G1R：GGCTCGAATGCCTTTACG；

ZKF：CCTCGTCGGATTCGTTCA，

ZKR：CACGGGTCATGCCTCAAT；

SJGF：GCGGTTGCACCGACTCAA，

SJGR：CTTGCTGGGCACGGTTTT；

BTCF：AAAGCACCGCTCGCTCAA，

BTCR：AATGGGTAACTCACGAACTAAAGAA；

引物对HBF/HBR以柚、葡萄柚、橙的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到443bp的条带；引物对HBF/HBR以宽皮橘、山金柑、枳的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到745-749bp的条带；引物对HBF/HBR将柚、葡萄柚、橙与宽皮橘、山金柑、枳类区分开；

引物对G1F/G1R以宽皮柑橘类的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到165bp的条带；引物对G1F/G1R以柚、葡萄柚、橙、山金柑、枳的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到196bp的条带；引物对G1F/G1R将宽皮柑橘类与柚、葡萄柚、橙、山金柑、枳区分开；

引物对ZKF/ZKR以枳的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到240bp的条带；引物对ZKF/ZKR以柚、葡萄柚、橙、宽皮柑橘类、山金柑的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到266bp的条带；引物对ZKF/ZKR将枳与柚、葡萄柚、橙、宽皮柑橘类、山金柑区分开；

引物对SJGF/SJGR以山金柑的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到129bp的条带；引物对SJGF/SJGR以柚、葡萄柚、橙、宽皮柑橘类、枳的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到154bp的条带；引物对SJGF/SJGR将山金柑与柚、葡萄柚、橙、宽皮柑橘类、枳区分开；

引物对BTCF/BTCR以柚、葡萄柚的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到168bp的条带；引物对BTCF/BTCR以橙的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到149bp的条带；引物对BTCF/BTCR将柚、葡萄柚与橙区分开。

3.一种分析亲本未知柑橘品种母本来源的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)DNA提取：提取待鉴定柑橘种质的基因组DNA；

(2)PCR扩增及检测：首先用引物HBF/HBR，以待鉴定品种的基因组DNA为模板进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测；

a：若检测到443bp的条带，则待鉴定品种的母本来源为柚或橙；进一步用引物BTCF/BTCR进行PCR扩增、电泳检测，若检测到168bp的条带则待鉴定品种的母本来源为柚，若检测到149bp的条带则待鉴定品种的母本来源为橙；

b：若检测到745-749bp的条带，则待鉴定品种的母本来源为宽皮橘、枳或山金柑；进一步分别用引物G1F/G1R、ZKF/ZKR、SJGF/SJGR进行PCR扩增、电泳检测，用引物G1F/G1R扩增检测到165bp的条带则待鉴定品种的母本来源为宽皮橘，用引物ZKF/ZKR扩增检测到240bp的条带则待鉴定品种的母本来源为枳，用引物SJGF/SJGR扩增检测到129bp的条带则待鉴定品种的母本来源为山金柑；

各引物序列如下：

HBF：CCCGCCCTTAGGAGATTG，

HBR：TCCCTCGGACTCGGAAAG；

G1F：ACGCTTTGGTTAGGCTTGG，

G1R：GGCTCGAATGCCTTTACG；

ZKF：CCTCGTCGGATTCGTTCA，

ZKR：CACGGGTCATGCCTCAAT；

SJGF：GCGGTTGCACCGACTCAA，

SJGR：CTTGCTGGGCACGGTTTT；

BTCF：AAAGCACCGCTCGCTCAA，

BTCR：AATGGGTAACTCACGAACTAAAGAA。