[发明专利]柯萨奇病毒A组16型单克隆抗体16E1及其制备方法

权利要求书

1.柯萨奇病毒A组16型单克隆抗体16E1，所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞株16E1产生，该杂交瘤细胞株于2019年8月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.C2019167，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株16E1的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)小鼠免疫

对6-8周龄BALB/c雌鼠使用CA16病毒免疫原进行免疫，每隔2周加强免疫一次，每次免疫前检测小鼠血清滴度，当小鼠血清滴度达到平台期后停止免疫，准备融合；

(2)融合杂交瘤的制备和筛选

(2.1)小鼠巨噬细胞的制备

将BALB/c小鼠处死，取腹腔细胞液溶解于HAT培养液或HT培养液中，直至细胞在培养液中的终浓度为2×10⁵个/mL；将细胞加入96孔细胞培养板，置培养箱培养，得到小鼠巨噬细胞；

(2.2)小鼠胸腺细胞的制备

将BALB/c小鼠处死，取出胸腺，将胸腺研磨后通过200目细胞筛，得到胸腺饲养细胞液；

(2.3)小鼠骨髓瘤细胞的制备

取小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0-Ag14(Sp2/0)，用20％FBS RPMI-1640培养液培养，选处于对数生长期细胞，融合前将骨髓瘤细胞从培养瓶移入离心管，用RPMI-1640培养液洗3次，用RPMI-1640培养液重悬细胞，计数；

(2.4)免疫脾细胞的制备

取待融合的BALB/C小鼠，处死后收集血液制成抗血清作为抗体检测的阳性对照；取小鼠脾脏，过200目细胞筛网后用研磨棒挤压研磨，滴加RPMI-1640培养液静置3-5min，取上2/3部分悬液移入50 mL塑料离心管中；本步骤反复2–3次，然后用RPMI-1640培养液洗细胞3次，再用RPMI-1640培养液重悬细胞并计数，得到免疫脾细胞；

(2.5)使用PEG促融剂融合制备杂交瘤

将1mL的PEG-1500、10mL的RPMI-1640无血清培养基和200mL完全培养基平衡至37℃；将步骤(2.3)制备的骨髓瘤细胞与步骤(2.4)制备的脾细胞混合于50mL离心管内，其中脾细胞与骨髓瘤细胞的个数比为10:1，1500rpm离心8min，轻轻弹击管底，使细胞疏松成糊状；吸取0.8mL PEG加入离心管内，加入10mL 37℃的RPM-1640完全培养液，温和搅拌，最后补加RPMI-1640培养液至40mL，1000rpm离心5min；弃上清，取HT培养液将细胞吹散，之后加入HT培养液；将所得细胞加入96孔细胞培养板，每孔100μL，放入CO2培养箱中培养12h后，在每个孔中滴加100μL HAT完全培养基；CO2培养箱中培养5天后，用HT完全培养基给孔中的细胞上清换液，换液体积比为50-100％；9-14天后，吸取上清进行检测；

(2.6)杂交瘤的筛选

使用间接ELISA法进行筛选，包被纯化的CA16病毒抗原100ng/孔，加入细胞上清50μL检测，挑选出阳性克隆孔；

(2.7)杂交瘤细胞的克隆化

利用克隆培养方法选出杂交瘤细胞，重复克隆2–3次，直到100％阳性后，得到杂交瘤细胞16E1。

3.权利要求1所述的单克隆抗体16E1在柯萨奇病毒A16型病毒抗原检测中的应用。