[发明专利]一种还原氧化石墨烯膜在冷冻电镜中的应用

说明书

本发明公开了一种还原氧化石墨烯膜在冷冻电镜中的应用。所述还原氧化石墨烯作为或用于制备生物冷冻电镜载网支持膜。所述还原氧化石墨烯按照包括如下步骤的方法制备：将氧化石墨烯转移至电镜载网上，经还原即得。由于目前支持膜的缺陷，冷冻样品的制作一直是一个大的挑战。寻找一种更稳定、导电性更高、背景噪音更低的支持膜是当前样品制作方面的工作重点。而还原氧化石墨烯是目前最符合实际应用的支持膜，解决了以往支持膜缺陷的同时，又存在自身其他一些诸如超高的机械强度等特性。可以预见，单层还原氧化石墨烯载网能够大规模生产，能够给冷冻电镜的制样以及后期三维重构带来极大便利。

技术领域

本发明涉及一种还原氧化石墨烯膜在冷冻电镜中的应用，属于生物冷冻电镜技术领域。

背景技术

冷冻电镜技术长期的发展，尤其是近几年在数据处理和相机硬件方面接连取得的突破性的进展，使得该方法突破了以往分辨率的局限性，近原子分辨率的结构解析变得较为普遍。该技术将处于生理条件下的溶于水中的样品快速冷冻，使得样品保存于非晶玻璃态的冰中。再用透射电子显微镜进行观察并收集照片。最后结合相关算法以及图像处理技术对分子进行三维重构。之前，由于不能达到很高的分辨率，该方法应用不广。近二十年来，直接电子探测相机的发明以及相关算法的优化基本上解决了这个问题，使得冷冻电镜能够达到近原子分辨率。冷冻电镜革命性的突破使其获得了蓬勃的发展。我国也抓住了这次机遇，应用该技术取得了一系列成绩，并在冷冻电镜领域占据一席之地。

经过近几年的应用和发展，冷冻电镜技术后期图像收集和处理已经较为成熟。然而，冷冻样品制作的技术发展，相对来说收效甚微。直至今天，样品的可重复性仍然不高，制作样品的条件仍需要根据不同样品不断去摸索。良好的冷冻样品需要非晶玻璃态冰的厚度适宜、生物大分子分布均匀并且处于非变性状态。由于后期图像处理技术的成熟，前期样品制作的问题逐渐凸显。一个良好的样品，往往成为得到高分辨率结构的关键。

应用于冷冻电镜样品制备的样品支撑载网上一般覆盖一层多孔碳膜，如果没有另外覆盖支持膜，孔中的大部分样品会存在于气液界面，而存在于气液界面的生物大分子往往会产生变性进而影响结构。多孔碳膜表面性质不均匀、导电性不佳并且机械刚性不强。导电性不佳会造成生物大分子在拍照时产生漂移进而影响最终结构的分辨率。通常情况下，为了解决这些问题，研究人员会在多孔碳膜上铺制一层无定形超薄碳膜。然而，这层无定型碳膜会带来较大的背景噪音，对后期图像处理带来极大困扰。近年来，也有课题组在尝试采用氮化硅或者金等材料作为支持膜。然而由于存在导电性差、在液氮温度下刚性差、制备工艺不成熟等问题，这些载网并没有得到广泛的应用。后来人们考虑一种背景很小的二维材料—石墨烯作为支持膜。石墨烯很薄，电子能够轻易穿过。此外，石墨烯超高的导电性和机械强度使得它成为一种理想的载网材料。然而，由于石墨烯的疏水性，生物大分子不易附着。有一种方法是将石墨烯氧化，氧化后的石墨烯具有亲水性，可以与生物大分子结合。然而，这降低了石墨烯的导电性，导电性降低会带来一系列困扰。此外，氧化石墨烯表面具有很多官能团，使得石墨烯膜厚度增加，背景噪音较强。因此，需要提供一种理想的新型冷冻电镜载网支持膜材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种还原氧化石墨烯膜(负载于电镜载网上)在生物冷冻电镜中的应用。

由于石墨烯超强的导电性和机械性能、均匀性以及超薄的特性，可以部分甚至完全消除目前电镜载网存在的背景噪音强、导电性差、大分子分布于气液界面等问题。由于氧化石墨烯虽然解决了石墨烯疏水的特性，但是降低了导电性，而还原之后可以补偿降低的导电性。此外，氧化石墨烯层与层之间存在较多官能团，层间距较大，而还原之后层间距减小，因此噪音相对更小。因此还原氧化石墨烯可作为生物冷冻电镜载网支持膜。

本发明采用的还原氧化石墨烯按照包括如下步骤的方法制备：

将氧化石墨烯转移至电镜载网上，经还原即得。

其中，所述氧化石墨烯可采用改进的Hummers法制备，具体可包括如下步骤：