[发明专利]靶向MMSA-1嵌合抗原受体修饰T淋巴细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种靶向MMSA-1嵌合抗原受体修饰T淋巴细胞，其特征在于：该细胞表面表达一种特异性的嵌合抗原受体，能特异性识别骨髓瘤细胞表面的MMSA-1抗原，发挥抗骨髓瘤效应；MMSA-1CAR片段序列如SEQ ID NO.1所示；其前端为CD8穿膜信号肽，其序列如SEQ ID NO.2所示；邻接MMSA-1scFv单链抗体，其序列如SEQ ID NO.3所示；后端依次为CD8跨膜区以及胞内4-1BB共刺激信号区和CD3ζTCR激活区，其序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种制备如权利要求1所述的靶向MMSA-1嵌合抗原受体修饰T淋巴细胞的方法，具体方法如下：

1)MMSA-1CAR质粒的制备：

野生型抗体经人源化改造后，获得MMSA-1scFv，片段前插入Mlu I酶切位点和CD8穿膜信号肽，片段后插入BamH I酶切位点；将合成的含Mlu I+CD8a-MMSA-1scFv+BamH I的pUC57-Amp质粒经过Mlu I和BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果，胶回收获得修饰后的基因片段；同时将含CD8跨膜区、4-1BB共刺激信号区和CD3ζTCR激活区的慢病毒骨架质粒pHR经过Mlu I和BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定之后胶回收长片段；将修饰后的MMSA-1scFv片段连接到慢病毒骨架质粒pHR中，提取质粒确定测序正确后，得到pHR-MMSA-1CAR质粒，其测序序列如SEQ ID NO.5所示；

2)MMSA-1嵌合型抗原受体慢病毒的制备：

将转染试剂和上述质粒逐滴加入无血清无抗生素的RPMI1640中，将最终的转染试剂及质粒混合液逐滴加到293T细胞汇合度为60％-70％的T175培养瓶中培养，收集转染72h的293T细胞上清液；将293T细胞上清液收集于离心管中使脱落的293T细胞离心至管底，将离心后的上清液用0.4μM过滤膜过滤，转移于超速离心管中真空25000rpm离心2小时，弃上清，将浓缩后的慢病毒重悬于l mL新鲜培养基；

3)CAR-T细胞的构建及体外扩增：

取50mL新鲜血液，通过淋巴细胞分离液进行密度梯度离心来分离单个核细胞；将单个核细胞按1-2×10⁶/mL重悬CTSTMAIM VTM SFM培养基中；同时添加5％ICS，CD3单抗50ng/mL和CD28单抗50ng/mL来激活T淋巴细胞，37℃5％CO2培养48h；

培养2天后，收集细胞，重悬细胞至1x10⁶/mL，按照MOI＝5加入上述浓缩后的慢病毒，同时加入终浓度为200U/mL IL-2和4ug/mLpolybrene，混匀，37℃5％CO2培养6-8小时，300g5min离心换液为新鲜含200U/mL IL-2的CTSTMAIM VTM SFM培养基；

每2-3天加入含200U/mLIL-2的新鲜CTSTMAIM VTM SFM培养基，维持细胞密度在1×10⁶/mL左右，扩增培养10-12天。

3.一种如权利要求1所述的靶向MMSA-1嵌合抗原受体修饰T淋巴细胞在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。