[发明专利]乳腺特异性表达人Amylin基因载体、转基因动物的构建方法及应用

说明书

本发明提供乳腺特异性表达人Amylin基因载体，还提供乳腺特异性表达人Amylin基因转基因动物及其应用。本发明利用β‑酪蛋白启动子启动人Amylin基因，构建了乳腺特异性表达人Amylin基因载体，并将该载体转入动物基因组中获得乳腺特异性表达人Amylin蛋白的转基因动物，其乳汁特异性表达人Amylin蛋白，且人Amylin基因在动物乳腺中的表达并未对动物的正常生理活动造成不良影响。因此，应用本发明可望通过转人Amylin小鼠、奶山羊或奶水牛的制备，获得大量廉价的人Amylin蛋白，并分离提纯生产药用人源Amylin，产生巨大的经济效益和社会效益。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及乳腺特异性表达人Amylin基因载体、转基因动物的构建方法及应用。

背景技术

胰淀素(Amylin/IAPP)是胰岛β细胞分泌的一种多肽类激素，由37个氨基酸构成，分子量为3.85KD。它和胰岛素一起表达、合成、分泌，被认为是胰岛素的孪生兄弟，以旁分泌方式负性调节胰岛素的分泌。目前认为，胰淀素作为胰岛第3种重要的活性激素，与胰岛素协同调节体内血糖平衡。正常情况下，胰淀素和胰岛素共同存在于胰岛β细胞中，在生理量的葡萄糖刺激下二者以1:20～100的比例同步分泌，共同维持血糖稳定。Hinshaw L.等研究表明胰淀素通过抑制胰高血糖素，参与餐后的血糖调控，并且胰淀素在中枢也存在相应的受体，可以刺激中枢产生饱腹感以及延缓胃排空。因此对于糖尿病患者降血糖，尤其是发生胰岛素抵抗的二型糖尿病病患可以使用胰淀素，在降低胰岛素使用量的同时达到更好的降糖效果。

目前，对Amylin的有关研究逐渐增多，对Amylin的生物学功能有了更多的认识，这将极大拓宽Amylin作为药用蛋白的应用前景。例如：Amylin调控中枢产热通路，显示了Amylin在治疗肥胖等疾病的应用中的应用前景；在低血糖发生时，胰淀素可以升高血糖，帮助低血糖恢复。然而Amylin只在胰岛β细胞中高表达，而与胰岛素共分泌的比例仅为1：20至1：100，从胰腺中提取纯化胰淀素极其昂贵，无法满足巨大的市场需求。通过原核表达方法纯化出的Amylin蛋白，由于无法确保其序列空间折叠的正确性，生产的蛋白难以保证具有生理活性。市场上的Amylin类似物普兰林肽蛋白主要依靠固相、液相合成法生产，生产工艺复杂且生产成本依然昂贵。因此，急需发展一种可以大量获得廉价Amylin蛋白的方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了乳腺特异性表达人Amylin基因载体、转基因动物的构建方法及应用。本发明通过构建一种乳腺特异性表达载体，使用原核显微注射技术生产转人Amylin基因的乳腺生物反应器，并通过泌乳得到药用人源Amylin蛋白，以满足市场对于Amylin蛋白的大量需求。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案为：

本发明提供乳腺特异性表达人Amylin基因载体，所述载体的构建方法为：首先获得人Amylin基因序列，然后将其密码子优化为哺乳动物偏好性密码子，并在其两端加入XhoI酶切位点，利用XhoI酶，酶切pBC1载体，分别构建pBC1-Amylin和pBC1-amylin的双荧光报告载体。

本发明还提供上述的乳腺特异性表达人Amylin基因载体在生产乳腺特异性表达人Amylin基因转基因动物中的应用。

本发明还提供乳腺特异性表达人Amylin基因转基因动物：将权利要求1所述的载体用SalI酶与NotI酶切回收，通过原核显微注射的方法，在雌雄原核融合期将酶切后的载体注入小鼠的受精卵，将注射后的受精卵移植入同期发情的代孕母鼠的输卵管处，制备乳腺特异性表达人Amylin基因转基因动物。

作为优选，所述转基因动物为转人Amylin基因FVB鼠。

作为优选，所述转基因动物为转基因小鼠、山羊或水牛。

本发明还提供上述的乳腺特异性表达人Amylin基因转基因动物在生产人Amylin蛋白中的应用。