[发明专利]高通量、自动化的细胞连续培养方法及其应用

说明书

本发明公开了一种高通量、自动化的细胞连续培养的方法及其应用。所述方法包括以下步骤：(1)提供细胞培养物，进行接种和培养；(2)进行细胞沉降，移除反应器中的上清液；(3)添加新鲜培养基；(4)根据上清液中的细胞密度，计算放流速率(B)，维持目标细胞密度；(5)重复上述步骤(2)～(4)，直到细胞连续培养完成。本发明提供的细胞连续培养模型与传统灌流反应器相比，其通量大、自动化程度高、培养体积小、花费低；与利用摇管进行培养相比，其反应器特征强、培养结果代表性高且不易出现人为误差，可靠性高。另外，本发明无需使用灌流反应器中额外的细胞截流装置，从而解决了细胞截留装置容易堵塞的问题。

优先权和相关申请

本申请要求2018年11月1日提交的名称为高通量、自动化的细胞连续培养方法及其应用的中国专利申请201811295263.4的优先权，该申请包括附录在内的全部内容作为参考并入本申请。

技术领域

本发明涉及生物制药和生物技术领域，具体涉及动物细胞培养技术领域，尤其涉及该领域中的高通量和自动化的细胞连续培养的方法及其应用。

背景技术

经过几十年发展，细胞培养技术已经成为生产很多重要蛋白(特别是那些糖基化的复杂大分子蛋白)的成熟技术。这些蛋白多用于预防和治疗一些严重的人类疾病，例如癌症、病毒感染、遗传缺陷疾病和其它慢性疾病。

目前体外细胞培养模型主要有分批培养、补料分批培养和连续培养三种。相对于分批培养和补料分批培养而言，连续培养(或称开放培养、灌流培养)因为其在生产上具有持续性、培养得到的细胞密度较高以及终产物一致性较好等方面的独特优势而越来越受到重视和推广。

目前，工业界中主要使用带有细胞截流装置的反应器(称为灌流反应器)进行细胞连续培养，其优点是细胞的高效截流和连续培养的稳健性。但也有其缺点，主要表现为：1)灌流反应器带有细胞截流装置和用于维持连续化培养的泵/秤/管路以及复杂的控制组件，其复杂的操作性极易造成人为失误，并且需要占用大量人工和时间进行日常操作和监视。2)细胞截流装置虽然截流效果好，但在长时间运行的情况下，截流膜孔容易堵塞导致反应器内目标蛋白的截留，蛋白收获率低且质量下降。3)灌流反应器规模通常较大(3L至200L不等)，培养时间长(30天至120天不等)，连续培养每天需要流加反应器培养体积1～2倍的培养基，长期培养对于培养基的消耗巨大，成本也会明显增加。

由于上述缺陷，灌流反应器不适用于高通量的培养基筛选和工艺优化。为了节省成本和提高效率，当前工业界使用最多的是用摇管代替灌流反应器进行高通量的筛选和优化实验。摇管体积小(20ml)，通量大，通过离心换液能模拟连续培养操作，因此能一定程度上代替反应器进行培养条件的初步筛选和优化。但是其缺点依然明显，主要为：1)不具备反应器特征，没有pH、溶氧、搅拌和通气控制，因此培养结果代表性差，不能有效地进行反应器放大；2)高通量实验通常需要很大的实验数量(20-100不等)，大量的摇管操作需要大量的人工，浪费人力成本；3)多数量且频繁换液极易引起人工操作误差，降低实验结果的真实性和代表性。

基于当前工业界中两种连续培养模型(即上文所述的灌流反应器和摇管)的缺陷，工业界需要一种高通量且自动化的细胞连续培养模型去克服或平衡上述缺陷，因此如何发展这样一种指导性的培养模型对于工业界意义重大。

Ambr15^TM是一种赛多利斯公司生产的高通量自动化微型生物反应器培养系统，其设计初衷是用于补料分批实验的高通量筛选和工艺优化，本领域技术人员并不认为其具备连续化培养的功能，并且现有技术中也没有记载其具备连续化培养的功能。本发明通过技术创新将细胞连续培养模型应用于Ambr15^TM系统，成功实现了细胞连续培养的高通量和自动化。

发明内容

发明要解决的问题