[发明专利]CD163突变基因及其在抑制或阻断猪产生抗体的方法和应用

权利要求书

1.一种CD163突变基因，其特征在于：包含如下用于制造CD163突变基因的特定序列：用于造成猪CD163基因突变的gRNA靶点序列、gRNA序列、造成CD163突变区域的序列和造成CD163基因突变的缺失的50碱基的序列；其中，

所述gRNA靶点序列如SEQ ID NO.1所示；

所述gRNA-F序列如SEQ ID NO.2所示；

所述gRNA-R序列如SEQ ID NO.3所示；

所述造成CD163基因突变区域序列SEQ ID NO.4所示；

所述造成猪缺失的50碱基的序列如SEQ ID NO.5所示。

2.一种如权利要求1所述的CD163突变基因在抑制或阻断猪产生抗体的方法，其特征在于：包含如下步骤：

1)构建猪CD163基因gRNA载体：CRISPR/cas9载体选用pX330载体；在猪CD163基因靶序列SEQ ID NO.4筛选打靶位点，其打靶序列为SEQ ID NO.1GGAAACCCAGGCTGGTTGGA；根据打靶序列分别合成寡聚核苷酸，其序列为SEQ ID NO.2和3，再用合成的互补的寡聚核苷酸制备双联DNA；所述载体构建步骤为：

(1)将两条寡聚核苷酸稀释至10μmol·L-1，各取10μL，混匀，在98℃反应10min，然后让其自然冷却至室温，完成退火形成双联DNA；

(2)用限制性内切酶Bbs I酶切pX330质粒DNA，切胶回收线性化的pX330质粒DNA片段；

(3)将回收的线性化的质粒DNA与退火的双链gRNA连接，而后转化Top10感受态细胞，在氨苄抗性的LB平板筛选重组质粒，挑取单菌落扩大培养，提取质粒DNA，筛选正确连接的重组质粒；

2)转染猪成纤维细胞：将原代大白猪胎儿成纤维细胞培养至70％—80％汇合度后，用pX330-CD163-gRNA质粒对其进行转染；转染48h后，取一半细胞提取DNA，用提取的DNA做模板，用PCR方法检测gRNA的打靶效率；PCR所用的引物为SEQ ID NO.6:CD163-F：5′-AAGCCCACTGTAGGCAGAA-3′和SEQ ID NO.7:CD163-R：5′-GTGGTTTCCCTCCTGGGG-3′；扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；61℃，30s，36个循环；72℃，30s；72℃，10min；

3)挑选单克隆细胞：将转染48h后的细胞接种在在10cm培养皿中，每3d更换一次培养液；铺板后10d可以观察到合适大小的克隆，将单克隆细胞进行扩大培养，同时取部分细胞提取基因组DNA用以鉴定其基因型；根据测序结果，筛选了一个在CD163双等位基因第七外显子缺失50个碱基的体细胞用做核移植，克隆CD163基因突变猪；

4)体细胞克隆制备CD163基因突变猪：以体外成熟的青年猪的卵母细胞为核移植受体细胞，将体细胞核移入去核的卵母细胞，经电融合与激活，构建克隆胚胎，挑选发育状态良好的克隆胚胎进行胚胎移植；待小猪出生后，检测小猪的基因型，筛选CD163基因突变猪；

5)建立CD163基因突变猪群：通过CD163双等位基因突变猪与野生型大白母猪杂交，获得F1代杂合子CD163基因突变猪，通过F1代杂合子猪间杂交获得CD163双等位基因突变猪或纯合子CD163基因突变猪；

6)对CD163双等位基因突变猪进行攻毒：将病毒扩增，检验毒性，而后模拟天然感染途径，通过鼻腔感染受试猪。感染后每天观察猪的临床症状，测量体温，每个两天采一次血液，测量血液中蓝耳病毒和其抗体的滴度。

3.一种如权利要求1所述的CD163突变基因在抑制、阻止猪产生抗体的应用。

4.一种CD163基因突变猪，其特征在于：应用如权利要求2所述CD163突变基因在抑制或阻断猪产生抗体的方法制备得到。