[发明专利]一种可实现肿瘤靶向递送核糖核蛋白复合物的纳米粒子的制备方法和应用

权利要求书

1.一种可实现肿瘤靶向递送核糖核蛋白复合物的纳米粒子的制备方法，其特征包括如下步骤：

1)顺-乌头酸酐修饰的聚乙二醇mPEG-CA的合成，

首先向容器中加入顺-乌头酸酐并加超干二氯甲烷充分溶解，然后加入草酰氯和二甲基甲酰胺在0℃-4℃下搅拌15-30分钟，恢复至室温继续反应1-3小时，顺-乌头酸酐与草酰氯的用量摩尔比为1:1.5；反应结束后旋转蒸发反应溶剂，继续加入超干二氯甲烷溶解反应产物并加入少量吡啶作为催化剂，随后加入单氨基封端的聚乙二醇在室温下反应3-5个小时；所述顺-乌头酸酐与单氨基封端的聚乙二醇的用量摩尔比为5:1；反应结束后加入等体积的饱和氯化铵终止反应，收集有机相，用冰乙醚沉淀，干燥后得棕色固体产物即为mPEG-CA；

2)环境响应性聚合物的合成，

2.1)首先将N-苄氧羰基-L-赖氨酸和三光气加入到容器中，加入超干四氢呋喃搅拌溶解，其中N-苄氧羰基-L-赖氨酸与三光气的用量摩尔比为1:1.5；在60℃-70℃油浴搅拌条件下反应2-4h，待反应澄清之后，用氩气除去容器中的残余三光气；浓缩反应液，快速加入预先准备好的过量正己烷中，放入冰箱过夜沉淀、抽滤，得到淡黄色固体，加入体积比为1:1的乙酸乙酯/正己烷溶液，加热溶解至微沸，趁热过滤去除去不溶物，得到饱和的N-苄氧羰基-L-赖氨酸酐Lys(Z)-NCA溶液，静置析出结晶，冰箱过夜；重复上述重结晶过程，抽滤，得到Lys(Z)-NCA；

2.2)将步骤2.1)得到的Lys(Z)-NCA溶解在无水DMF中，通过加入正丁胺作为引发剂进行聚合，Lys(Z)-NCA与正丁胺的用量摩尔比为120:1；将反应混合物在30℃-40℃下通入干燥氩气搅拌48-72小时；然后减压蒸发溶剂，将所得产物溶于少量CHCl₃中，然后使用过量的乙醚沉淀，得到聚N-苄氧羰基-L-赖氨酸PLys(Z)；在0℃-4℃下，通过将HBr加入到PLys(Z)的CF₃COOH溶液中，脱除PLys(Z)上苄氧羰基；反应1-3小时之后，将反应混合物沉淀在过量的冰乙醚中；将沉淀重新溶解在DMF中，通过220nm微孔过滤器过滤纯化；滤液在过量的乙醚中沉淀以除去残留的CF₃COOH，并得到聚赖氨酸PLys；然后将产物在室温下真空干燥；

2.3)将步骤2.2)得到的PLys溶解在pH＝8.0-9.0的碳酸氢钠缓冲溶液中，然后加入步骤1)中得到的mPEG-CA反应，mPEG-CA与PLys的用量摩尔比为8：1；在整个反应过程中不断滴加0.2N的氢氧化钠溶液使整个反应体系的pH保持在8.0-9.0；反应结束后，使用透析袋将未反应的mPEG-CA除去，然后将透析液冻干得到环境响应性聚合物PLys-CA-mPEG；

3)纳米核糖核蛋白复合物的制备

在室温下，首先将Cas9蛋白和sgRNA等体积混合并孵化15min形成核糖核蛋白复合物，Cas9蛋白和sgRNA的摩尔比为0.5:1-2:1；随后加入步骤2)中得到的环境响应性聚合物PLys-CA-mPEG与核糖核蛋白复合物进一步培养15min以形成纳米核糖核蛋白复合物，PLys-CA-mPEG与sgRNA的质量比为1:1-4:1。

2.权利要求1所述方法制备的可实现肿瘤靶向递送核糖核蛋白复合物的纳米粒子的应用，其特征是包括以下方面：

1)在血清中保护sgRNA避免酶降解方面的应用；

2)在微酸性环境下促进细胞对核糖核蛋白复合物摄取方面的应用；

3)在促进核糖核蛋白对肿瘤细胞进行基因编辑方面的应用；

4)在携带组合sgRNA时对多种肿瘤细胞同时进行基因编辑方面的应用；

5)体内促进核糖核蛋白复合物在肿瘤部位富集方面的应用。