[发明专利]抗B7-H3嵌合抗原受体的编码基因、制备方法、具有该基因的质粒、免疫细胞及其应用

权利要求书

1.抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因，其特征在于，至少包含了表达IL15和CCL21的人工核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因，其特征在于：所述抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因中，包括抗原结合区、跨膜结构区、共刺激信号传导区和T细胞信号传导区功能结构域。

3.如权利要求2所述的抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因，其特征在于：包括顺序连接的

(1)导引子Leader核酸人工序列(SEQ ID NO.2)

(2)Anti-B7-H3 antigen antibody single chain Fv antibody(scFv)核酸人工序列(SEQ ID NO.3)

(3)CD8Hinge区核酸人工序列(SEQ ID NO.4)

(4)CD8跨膜区核酸人工序列(SEQ ID NO.5)

(5)CD226胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.6)

(6)CD3ζ胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.7)

(7)T2A-IL15-CCL21核酸人工序列(SEQ ID NO.8)。

4.如权利要求3所述的抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因，其特征在于：所述抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因的核苷酸序列表如SEQ ID NO.1所述。

5.制备如权利要求4所述抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)分别按融合基因片段导引子Leader的核酸人工序列、Anti-B7-H3的核酸人工序列、CD8的核酸人工序列、linker的核酸人工序列、CD8TM的核酸人工序列、CD226的核酸人工序列、CD3ζ的核酸人工序列、T2A-IL15-CCL21核酸人工序列的顺序委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，插入pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro中，得到pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21；

(2)将pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21进行双酶切，利用琼胶电泳将含有CAR(B7-H3)-IL15-CCL21的DNA片段琼胶部位切下，通过溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的CAR(B7-H3)-IL15-CCL21 DNA片段，即为所述的抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因。

6.质粒，其特征在于：具有如权利要求4所述的抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因，且采用包括如下步骤的方法制备得到：

分别按融合基因片段Leader-scFv(B7-H3)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的顺序插入pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro载体(Invitrogen)NotI-AsiSI位点，转化到E.coli(DH5α)，通过菌液PCR鉴定后，使用Qiagen公司的质粒提取试剂盒提取质粒，质粒经测序正确后，将测序结果正确的重组质粒命名为pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21。

7.免疫细胞，其特征在于：具有如权利要求4所述的抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因，且所述免疫细胞选自自体的CIK细胞。

8.如权利要求7所述的免疫细胞，其特征在于：采用如下的制备方法得到：利用pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21质粒转染慢病毒包装细胞系293T，然后在慢病毒感染CIK细胞。