[发明专利]一种半合子BAK细胞的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种半合子BAK细胞的制备方法，其特征在于，包括：将单个核细胞在含有生物反应调节剂组合I的细胞培养基中进行活化后再进行扩增培养；

所述单个核细胞的初始接种浓度为1×10⁶～3×10⁶/mL；

所述生物反应调节剂组合I由抗人CD3单克隆抗体、白介素2、唑来膦酸和干扰素γ组成；

所述含有生物反应调节剂组合I的细胞培养基中，所述白介素2和所述干扰素γ的浓度比为（1~2）:1；其中，所述抗人CD3单克隆抗体的浓度为50～300ng/mL，所述唑来膦酸的浓度为1～10μmol/L，所述干扰素γ的浓度为500U～1000U/mL，所述白介素2的浓度为500U～1000U/mL；

所述扩增培养包括：在活化培养2~4天后，向活化培养体系中补加活化培养体系体积的20~40%的含有生物反应调节剂组合II的无血清培养基和活化培养体系体积1~10%的灭活血清；以后每隔1~3天补加培养体系体积50%~100%的含有白介素2的无血清培养基和培养体系体积1~3%的灭活血清；

所述生物反应调节剂组合II由唑来膦酸和白介素2组成，所述含有生物反应调节剂组合II的无血清培养基中，所述唑来膦酸的浓度为1～10μmol/L，所述白介素2的浓度为500U～1000U/mL；

所述含有白介素2的无血清培养基中，所述白介素2的浓度为500U～1000U/mL。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞培养基以无血清培养基为溶剂，还含有体积百分含量为1~10%的灭活血清。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述无血清培养基包括选自RPMI1640培养基、AIM-V培养基、KBM581培养基、X-VIVO 15培养、SCGM培养基、OpTmizer培养基中的一种或多种。

4.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述单个核细胞的制备包括如下步骤：

（1）采集外周血经肝素钠抗凝处理后分离血细胞或利用单采机、枸橼酸钠抗凝处理获得血细胞，利用注射用生理盐水将所述血细胞进行1~5倍比例的稀释；

（2）在稀释的血细胞中加入人淋巴细胞分离液，在20℃～25℃条件下，1800rpm～2500rpm离心15～25分钟；所述稀释血细胞与所述人淋巴细胞分离液的体积比为（1~3）：1；

（3）吸取中间层液体于50～60℃放置30～60分钟，在4℃～8℃条件下，3000rpm～3500rpm离心25～30分钟；

（4）吸取位于中间层的白膜层，清洗2~3次后以所述无血清培养基悬浮。