[发明专利]一种基于叶绿体DNA差异的籼粳稻米种类荧光PCR快速检测鉴定方法

说明书

本发明提供一种基于叶绿体DNA序列差异的籼粳稻米种类荧光PCR快速检测鉴定方法。以正向引物F4：3’‑AATCGCAACCCCTTTCCGC‑5’，反向引物R1：3’‑TTGAGGATTATTCCATGATTCC‑5’，建立了籼‑粳稻米叶绿体DNA SYBR Green荧光PCR检测方法，PCR扩增产物籼稻为135 bp、粳稻为204 bp片段，2种稻米的SYBR Green荧光PCR扩增熔解温度（Tm）为：籼稻Tm值为76.5℃，粳稻Tm值为78.0℃，二者Tm值差为1.5。该熔解温度（Tm）的差别，用于判别鉴定待测稻米所属的种类。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于叶绿体DNA序列差异的籼粳稻米种类荧光PCR快速检测鉴定方法。

背景技术

稻米是多数国家的主粮，也是我国南方地区的主粮，同时也是重要的加工食品的主要原料，主要有2个亚种，即籼稻（米）亚种（Hsien rice, 国际上也称为Indica rice）与粳稻（米）亚种（Kengrice, 国际上也称为Japonica rice）^[1]，由于稻米种类不同，其商品价值也不一样，因此，有必要进行区分鉴别。从稻谷形态上看，2个亚种之间有一定的区别，但经加工成稻米后，要做到精准鉴定，难度较大，稻米粉碎后加工成米制品，完全无法从形态学上加以鉴别。因此，有必要建立稻米种类的DNA鉴定方法。本发明涉及一种基于叶绿体DNA序列差异的籼粳稻米种类荧光PCR快速检测鉴定方法。该方法的应用，对大米及其加工产品的物种类别的鉴定，维护良好大米及其制品的贸易市场秩序，保护消费者利益，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于叶绿体DNA序列差异的籼粳稻米种类荧光PCR快速检测鉴定方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一对检测鉴定籼粳稻米种类的荧光PCR引物：F4：3’-AATCGCAACCCCTTTCCGC-5’；R1：3’-TTGAGGATTATTCCATGATTCC-5’。

一种基于叶绿体DNA序列差异的籼粳稻米种类荧光PCR快速检测鉴定方法：以粳稻、籼稻的总DNA为模板，以F4/R1为引物，分别进行SYBR Green荧光PCR扩增；

PCR反应体系：2×SYBR Premix Ex Taq 12.5μL，引物F4/R1各0.5μL，总DNA 2μL（200ng），ddH₂O补足至25μL；

反应条件：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃34s，40个循环；65℃~95℃熔解曲线分析。

上述方法中： SYBR Green荧光PCR扩增产物籼稻为135 bp、粳稻为204 bp片段，SYBR Green荧光PCR扩增熔解温度（Tm）为籼稻Tm值76.5℃，粳稻Tm值78.0℃，二者Tm值差为1.5；该熔解温度（Tm）的差别，用于判别鉴定待测稻米所属的种类。

本发明的优点在于：

本发明提供一种基于叶绿体DNA序列差异的籼粳稻米种类荧光PCR快速检测鉴定方法。利用籼粳稻米叶绿体DNA序列差异性，即籼稻叶绿体DNA缺失69 bp片段^[2]，设计特异性引物，通过荧光PCR快速检测鉴定；PCR扩增产物籼稻为135 bp、粳稻为204 bp片段；荧光PCR扩增熔解温度，籼稻Tm值为76.5℃，粳稻Tm值为78.0℃；通过扩增产物与熔解温度的双重差异，准确快速鉴别籼、粳两种稻米。对大米及其加工产品的物种（实际上是籼粳亚种）类别的鉴定，维护良好大米及其制品的贸易市场秩序，保护消费者利益，具有重要意义。

附图说明

图1 SYBR Green荧光PCR结果。A：扩增曲线；B：熔解曲线。