[发明专利]一种密码子优化的葡萄糖氧化酶基因及其应用

说明书

本发明提供了一种密码子优化的葡萄糖氧化酶基因，所述基因来源于AspergillusnigerAn76，其序列如SEQ ID No.2所示。该原始的葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中无法成功表达，经过序列优化，其能够在毕赤酵母中顺利表达，并且，经过分离、纯化，能够得到纯化的目的蛋白，该重组葡萄糖氧化酶可以用于葡萄糖生物传感器中。

技术领域

本发明涉及生物酶基因工程和生物传感技术领域，具体涉及一种密码子优化的葡萄糖氧化酶基因及其在制备生物传感元件中的应用。

背景技术

目前，我国生物发酵产品总量居世界第一位，其中葡萄糖是发酵产品重要的质量控制指标，快速、准确检测发酵产品中的葡萄糖含量对于保证发酵产品质量具有重要意义。发酵产品中葡萄糖的传统检测方法主要包括高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、旋光以及薄层色谱法，但是这些检测方法面临分析成本高、操作繁琐等各种问题。而生物传感器法具有灵敏度高、重现性好、操作简单的特点而受到广泛青睐。

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase(GOD))是葡萄糖生物传感器中主要的检测敏感元件，GOD是一种黄素蛋白，以氧气为电子受体催化β-D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸-δ-内酯和H₂O₂，目前我国GOD主要分离纯化自黑曲霉或青霉，这种来源的酶产量很低而且纯化过程繁琐，这就导致生产的葡萄糖氧化酶远远不能满足应用需求，大部分商品化酶的来源依赖Sigma等国外公司，作为酶电极的“微芯片”，长期依赖进口，容易导致“卡脖子”的问题。

葡萄糖氧化酶活性中心深埋在酶分子内部，酶分子与电极之间很难进行直接电子传递，目前研究较多的是利用具有导电性高、表面活性中心多、生物相容性好等特殊性质的纳米材料作为电子导线介导酶与电极之间的电子传递，许多纳米材料，如纳米金属、纳米氧化物以及碳纳米管，已经用于葡萄糖氧化酶传感器中酶电极传感器的制作，并使传感器的传感性能得到明显提升。但是这些传感器的酶负载量、灵敏度、检测范围、响应时间等有待进一步改进，因此需要进一步研究葡萄糖氧化酶、纳米材料与电极之间的直接电化学。

毕赤酵母具有遗传背景清晰、外源蛋白表达量高、可对蛋白进行正确折叠、修饰和加工、可进行高密度发酵等优势，因此可作为外源蛋白的优良表达宿主。但是，将不同来源的葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中进行表达时，通常会遇到无法成功表达的情况，需要对葡萄糖氧化酶的基因序列进行优化；对基因序列进行优化的方式多种多样，如何调整基因序列并使其在毕赤酵母中顺利表达是很难预期的。

发明内容

本发明提供了一种密码子优化的葡萄糖氧化酶。

本发明提供的密码子优化的葡萄糖氧化酶基因来源于AspergillusnigerAn76，其原始的基因序列如SEQ ID No.1所示，经过序列优化的基因序列如SEQ ID No.2所示。该原始的葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中无法成功表达，经过序列优化，其能够在毕赤酵母中顺利表达，并且，经过分离、纯化，能够得到纯化的目的蛋白。

另一方面，本发明还提供了包含葡萄糖氧化酶基因的重组载体。本发明所述的载体包括克隆载体以及表达载体。

在一个实施方案中，所述克隆载体包括pUC系列的载体，例如，pUC18、pUC19；所述表达载体包括在大肠杆菌中表达的载体以及在毕赤酵母中表达的载体，优选的，包括pET系列的载体，如pET-21a；更优选的，所述在毕赤酵母中表达的载体为pPIC9K载体。

另一方面，本发明还提供了包含上述重组载体的重组菌株；所述菌株包括大肠杆菌或毕赤酵母；优选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。

另一方面，本发明还提供了一种制备重组葡萄糖氧化酶的方法，所述方法包括，利用序列优化的葡萄糖氧化酶基因转化到毕赤酵母中，构建重组表达葡萄糖氧化酶的毕赤酵母，然后，对重组的毕赤酵母进行培养，并对重组的葡萄糖氧化酶进行纯化；优选的，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。