[发明专利]一种产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌

权利要求书

1.一种产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，其特征在于，将恶臭假单胞菌(pseudomonas putida )ATCC 33015中二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因克隆到大肠杆菌，同时调节二甲苯单加氧酶双亚基基因xylM与xylA在基因组的拷贝数比例为1:1～3:3，从而构建不同的产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌，其构建方法，包括如下步骤：

步骤1.构建产5-甲基吡嗪-2-羧酸重组大肠杆菌：

先构建二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因整合框，通过同源重组将整合框代替大肠杆菌BL21(DE3)基因组中鞭毛区基因flhD，得到产5-甲基吡嗪-2-羧酸重组大肠杆菌E. coli MPCA1，其中；xylM与xylA在基因组的拷贝数比例为1:1；

步骤2. 构建不同二甲苯单加氧酶双亚基基因xylM和xylA拷贝数比例的重组大肠杆菌，xylM与xylA在基因组的拷贝数比例为1:1～3:3范围，在重组大肠杆菌E. coli MPCA1的基础上，将xylM或xylA分别整合到鞭毛区基因motA位点，构建xylM：xylA=2:1的E. coliMPCA2或xylM：xylA=1:2的E. coli MPCA3，或；

在重组大肠杆菌E. coli MPCA1的基础上，将xylM-xylA整合到motA位点，构建xylM：xylA=2：2的E. coli MPCA4，或；

在E. coli MPCA2的基础上，将xylM整合到鞭毛区基因cheW位点，构建xylM：xylA=3：1的E. coli MPCA5，或；

在E. coli MPCA3的基础上，将xylA整合到鞭毛区基因cheW位点，构建xylM：xylA=1：3的E. coli MPCA6，或；

在E. coli MPCA5的基础上，将xylA整合到鞭毛区基因cheY位点，构建xylM：xylA=3：2的E. coli MPCA7，或；在E. coli MPCA6的基础上，将xylM整合到鞭毛区基因cheY位点，构建xylM：xylA=2：3的E. coli MPCA8，或；

在E. coli MPCA4的基础上，将xylM-xylA整合到cheW位点，构建xylM：xylA=3：3的E. coli MPCA9。

2.根据权利要求1所述产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的二甲苯单加氧酶双亚基基因分别如NCBI上Gene ID: 1218754和Gene ID: 1218743所示，苯甲醇脱氢酶基因如Gene ID: 9121238所示，苯甲醛脱氢酶基因如Gene ID: 1218745所示。

3.根据权利要求1所述产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，其特征在于，利用CRISPR/cas9将二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因整合flhD位点。

4.根据权利要求1所述产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，其特征在于，利用CRISPR/cas9将二甲苯单加氧酶终端羟化酶基因xylM、电子传递蛋白基因xylA和二甲苯单加氧酶基因xylM-xylA整合至motA、cheW、cheY位点。

5.应用权利要求1-4任一所述产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌发酵生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于，将37℃，220rpm下培养12h的重组大肠杆菌以1%的接种量转入发酵培养基于37℃，220rpm发酵12h，离心收集细胞在加入12g/L底物DMP的pH 8的缓冲液中进行催化36h。