[发明专利]GPBB胶乳增强比浊法检测试剂盒及其制备使用方法

权利要求书

1.一种GPBB胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的R1和R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：

R1：

R2：

2.根据权利要求1所述的GPBB胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，包括的成分及相应含量为：

R1：

R2：

3.根据权利要求1所述的GPBB胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，还包括GPBB校准品，包括的成分及相应含量为：

4.根据权利要求3所述的GPBB胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述GPBB校准品包括的成分及相应含量具体为：

5.根据权利要求3所述的GPBB胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述GPBB校准品中rGPBB具体为重组人GPBB蛋白，获取方法具体如下：

①人GPBB基因的获取：

参考GENBANK登录号NM_002862.4，上游添加酶切位点SnaB I，并添加柔性linker以保护目的片段的空间结构，下游添加酶切位点Not I和保护碱基，获得如SEQ ID NO.1所示基因序列；得到基因序列后，送基因公司合成，测序合格，获得目标基因序列；

②表达载体构建：

使用SnaB I和Not I两种内切酶对合成的基因及pPIC9K质粒进行双酶切，将双酶切产物使用连接酶连接，并电转导入毕赤酵母感受态细胞中，涂布于含100mg/L Zeocin的YPD平板上，28℃恒温培养36h，挑取抗性平板上生长的菌落送往基因测序鉴定目的基因，符合度99.99％，鉴定为阳性，表示表达载体构建成功，记为GS15/rGPBB工程菌；

③重组人GPBB的表达和纯化：

取经测序GPBB阳性菌于BMGY培养基中摇床培养，培养条件为28℃、250r/min，培养至OD600为2～6时，离心收集菌体；用BMMY培养基重悬菌体，至OD600为1，继续摇床发酵，并且，每24h向培养基中添加无水甲醇至终浓度为1％；培养48h终止，于12000rpm/min转速下离心5min，取上清，即得目的蛋白rGPBB粗制品；

将上述目的蛋白rGPBB粗制品加入肠激酶，并于23℃水浴下酶切过夜；酶切后，将粗制蛋白过滤处理，过GST亲和层析柱，并用第一Elution buffer梯度洗脱，收集rGPBB峰；过脱盐柱，用脱盐柱缓冲液置换，再分别用Loading buffer平衡好柱体，上样后用第二Elutionbuffer梯度洗脱，收集rGPBB峰；将获得的rGPBB过分子筛层析柱，用第三Elution buffer收集rGPBB峰；其中，所述第一Elution buffer的配方为：50mM Tris-Cl，40mM还原性谷胱甘肽，pH 7.0；所述脱盐柱缓冲液的配方为：50mM Tris-Cl，pH 9.0；所述Loading buffer的配方为：50mM Tris-Cl，pH7.0；所述第二Elution buffer的配方为：50mM Tris-Cl，1M NaCl，pH7.0；所述第三Elution buffer的配方为：50mM Na₂HPO₄，0.15M NaCl，pH7.0；

使用GPBB抗体为第一抗体，使用HRP标记的山羊抗兔IgG为第二抗体做WB，当收集的上述rGPBB蛋白样本在110kD处有阳性条带，即表明纯化后所得rGPBB为目标所需的重组人GPBB蛋白；此时，加入终浓度20％甘油无菌分装，于-80℃保存备用。

6.根据权利要求1-5任一所述的GPBB胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述偶联山羊抗人GPBB多克隆抗体的胶乳微球的获取方法为：使用直径为30～60nm的聚苯乙烯胶乳微球，并采用共价偶联法将山羊抗人GPBB多克隆抗体偶联到聚苯乙烯胶乳微球上。