[发明专利]一种酶法检测苯丙氨酸与酪氨酸含量的方法及其应用

权利要求书

1.一种酶法检测苯丙氨酸与酪氨酸含量的方法，其特征在于：利用苯丙氨酸脱氢酶Phenylalanine Dehydrogenase，测定苯丙氨酸与酪氨酸的含量。

2.根据权利要求1所述的一种酶法检测苯丙氨酸与酪氨酸含量的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）蛋白的外源表达及分离纯化

1）制备苯丙氨酸脱氢酶Phenylalanine Dehydrogenase目的基因；

2）将步骤 1）所得的苯丙氨酸脱氢酶Phenylalanine Dehydrogenase目的基因连入pET28a表达载体，得到pET28a-PheDH质粒；

3）将pET28a-PheDH质粒转入大肠杆菌Rosetta菌株中后在培养基中进行培养，得到苯丙氨酸脱氢酶Phenylalanine Dehydrogenase目的蛋白；

4）分离纯化目的蛋白；

（2）利用分离纯化得到的目的蛋白，通过酶法对样品中的苯丙氨酸与酪氨酸的含量进行检测。

3.根据权利要求2所述的一种酶法检测苯丙氨酸与酪氨酸含量的方法，其特征在于，所述步骤4）中分离纯化目的蛋白的步骤为：

A、将步骤3）得到的含有苯丙氨酸脱氢酶Phenylalanine Dehydrogenase目的蛋白的菌液低温离心，去除上清液，收集菌体，加入缓冲液A，并将菌体悬浮于缓冲液A中；

B、破碎菌体后，离心，收集上清液；

C、上清液过镍柱，用洗脱液进行洗脱；

D、将洗脱得到的酶液置于超滤管中进行离心、浓缩，浓缩后的蛋白溶液分装，即可得到分离纯化目的蛋白。

4.根据权利要求3所述的一种酶法检测苯丙氨酸与酪氨酸含量的方法，其特征在于，所述步骤A中，离心的反应温度为4~16 ℃，转速为10000~12000rpm；所述步骤D中，离心的反应温度为4~16℃，转速为5000~6000 rpm。

5.根据权利要求3所述的一种酶法检测苯丙氨酸与酪氨酸含量的方法，其特征在于，所述步骤A中，缓冲液A由以下组分组成：1 L缓冲液A中含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷、37.3 g氯化钾以及100 ml甘油；所述步骤D中，在浓缩的过程中加入缓冲液B，并将蛋白悬浮于缓冲液B中；缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷、7.45 g氯化钾、200 ml甘油以及0.154 g二硫苏糖醇。

6.根据权利要求3所述的一种酶法检测苯丙氨酸与酪氨酸含量的方法，其特征在于：所述步骤C中，洗脱液中含有咪唑，洗脱液中咪唑浓度为20-500mmol/L。

7.根据权利要求2所述的一种酶法检测苯丙氨酸与酪氨酸含量的方法，其特征在于：所述步骤（2）中双酶偶联法为终点法或初速度法。

8.根据权利要求7所述的一种酶法检测苯丙氨酸与酪氨酸含量的方法，其特征在于，所述终点法的检测步骤如下：配制浓度在0~4 mmol/L之间的苯丙氨酸与酪氨酸标准品溶液，每个浓度分别取10 μl并分别滴入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，混匀，30~40℃下反应15~30分钟后结束反应，并使用酶标仪读取340 nm处吸光值，以吸光值为纵坐标，以苯丙氨酸与酪氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制苯丙氨酸与酪氨酸浓度标准曲线。

9.根据权利要求7所述的一种酶法检测苯丙氨酸与酪氨酸含量的方法，其特征在于，所述初速度的检测步骤如下：配制浓度在0~4mmol/L之间的苯丙氨酸与酪氨酸标准品溶液，每个浓度分别取10 μl并分别滴入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，混匀，30~40℃下反应2~10分钟，并使用酶标仪监测反应进程中340nm处吸光度的变化量，以2~10分钟内的340nm处吸光度变化值为纵坐标，以苯丙氨酸与酪氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制苯丙氨酸与酪氨酸浓度标准曲线。

10.根据权利要求8或9所述的一种酶法检测苯丙氨酸与酪氨酸含量的方法，其特征在于，每190 μl的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液，100 μl；β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液，10~30 μl；酶液，5~10μl；补足超纯水至190 μl。