[发明专利]检测烟蚜对吡虫啉抗药性的引物对及检测方法

权利要求书

1.一种检测烟蚜对吡虫啉抗药性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，提取待检测烟蚜样本RNA；

S2，将RNA反转录成DNA；

S3，以DNA作为模板，以引物对作为扩增引物，进行PCR扩增，其中，所述引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

S4，对扩增产物回收纯化；

S5，将纯化后的目的片段连接到载体；

S6，将连接产物转入感受态细胞，培养获取菌液；

S7，对菌液进行测序判别：以烟蚜敏感种群目的基因氨基酸序列作为参比序列来进行判别，如果出现第169位的缬氨酸变成丙氨酸、第244位的甘氨酸变成精氨酸和第515位的异亮氨酸变成苏氨酸三个位点同时突变，则判定所测烟蚜样本对吡虫啉产生了抗性；

其中，所述参比序列如下：

MAAKDVKFGNEARIKMLRGVNVLADAVKVTLGPKGRNVVLDKSFGAPSITKDGVSVAREIELEDKFENMGAQMVKEVASKANDAAGDGTTTATLLAQSIVNEGLKAVAAGMNPMDLKRGIDKAVISAVEELKNLSVPCSDSKAITQVGTISANADEKVGALIAEAMEKVGNDGVITVEEGTGLQNELEVVKGMQFDRGYLSPYFINKPETGIVELENPYILMADKKISNVREMLPILESVAKSGKPLLIISEDLEGEALATLVVNSMRGIVKVAAVKAPGFGDRRKAMLQDISILTGGSVISEELAMELEKSTLEDLGQAKRVVISKDTTTIIGGVGEKHTIQSRISQIRQEIQEATSDYDKEKLNERLAKLSGGVAVLKVGAATEVEMKEKKARVEDALHATRAAVEEGVVAGGGVALVRVAGKISNLRGQNEDQNVGIRVALRAMEAPLRQIVSNSGEEPSVVTNNVKDGKGNYGYNAATDEYGDMIDFGILDPTKVTRSALQYAASVAGLMITTECMVTDLPKEDKSSDSNSSPAGGMGGMGGMM。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增使用的反应体系为：

DNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，12.5μL Ex Primer Taq^TM，9.5μL ddH₂O；总体积25μL，上游引物和下游引物的浓度均为10μM；

所述PCR扩增使用的反应条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸5min；4℃保存；完成PCR扩增。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目的片段连接的反应体系为：1μLpMD19-TVector，4μL目的片段，5μL Solution I；反应条件为：微离心混匀后，16℃连接过夜，得连接液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述连接产物加入感受态细胞培养获取菌液的方法为：

(1)在连接液中加入10μLDH5α感受态细胞，冰上放置30min，轻弹；

(2)42℃水浴45s，取出冰上放置1min；

(3)加入890μL LB液体培养基，37℃，150rpm振荡培养60min；

(4)取0.25mL灭菌PCR管，加入30μL无菌水，用10μL的枪头在过夜培养的平板上挑取阳性单菌落溶于无菌水中；

(5)在0.25mL的RCR管中配制25μL的PCR反应体系，进行菌落PCR鉴定：12.5μL ExPrimer Taq^TM、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、3μL菌液、8.5μL ddH₂O，上游引物和下游引物的浓度均为10μM；

(6)上述反应体系按按以下程序进行PCR反应：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸5min；4℃保存样品；

(7)1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件：130V，25min；

(8)将检测有条带的菌液加入含0.1％Amp的LB液体培养基中，37℃扩大培养。