[发明专利]一种可限制激活CRISPR/Cas13a的双锁纳米粒子的制备方法和应用

说明书

一种可限制激活CRISPR/Cas13a的双锁纳米粒子的制备方法和应用，这种纳米颗粒(DLNP)只能在肿瘤组织中限制CRISPR/Cas13a的激活，以进行有效的癌症免疫治疗。DLNP设计为核‑壳结构，其中CRISPR/Cas13a封装在核内，被一层双响应聚合物网络覆盖。在聚乙二醇外壳的保护作用下，DLNP表现出血液循环稳定性。在低pH和高H₂O₂的肿瘤微环境中，DLNP选择性将CRISPR/Cas13a释放。使用这种双锁纳米颗粒，在小鼠中观察到有效的肿瘤生长抑制作用，无明显副作用。由于CRISPR/Cas13a的临床应用主要受到不可控激活所带来毒副作用限制，因此这种双锁纳米粒子为精确控制CRISPR/Cas13a的激活及在有效癌症治疗中的应用提供了一种可行的方法。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种可限制激活CRISPR/Cas13a的双锁纳米粒子的制备方法和应用。

背景技术

癌症的特征是多种遗传改变或突变所引起的异常代谢和增殖。肿瘤细胞在药物代谢过程的基因突变或药物靶点的修复可引起细胞对传统疗法的耐受。最近，一种新型的簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关酶(Cas)，Cas13a(以前称为C2c2)被鉴定为RNA导向的靶向RNA的CRISPR效应子。Cas13a/CRISPR RNA(crRNA)复合物在靶标目的RNA后同样会激活一般的RNase活性，导致细胞RNA的非特异性裂解，并最终导致程序性细胞死亡或休眠(即“附带效应”)。这种独特的“附带效应”自动绕过了实体瘤对传统疗法的复杂耐药性和逃逸机制，从而使CRISPR/Cas13a系统成为癌症治疗的理想治疗剂，具有降低有效剂量和最小化的耐药性的潜能。

但是，这种“附带效应”并不是专门针对肿瘤细胞的，因为一旦任何细胞的RNA达到与Cas13a/crRNA复合物的互补结合，它就可以被激活。当全身施用基于CRISPR/Cas13a系统的药物时，可能会导致与肿瘤以外的组织中不希望的细胞死亡有关的安全性问题。因此，仅在肿瘤细胞中限制CRISPR/Cas13a系统激活的可行策略对于基于CRISPR/Cas13a的药物在癌症治疗中的安全应用至关重要。为了实现对体内CRISPR/Cas13a激活的精确控制，将基于CRISPR/Cas13a的试剂特异地递送到肿瘤组织中至关重要。肿瘤微环境(TME)，特别是酸性微环境(pHe)，是实体瘤的典型特征。基于这一特征，已经成功开发了几种pH响应性非病毒载体(包括无机纳米颗粒和聚合物)来递送CRISPR系统。但是，某些酸性细胞器或其他外部酸性刺激也可能触发CRISPR/Cas13a激活，从而导致潜在的安全问题和严重的副作用。因此，需要更加精确控制的CRISPR/Cas13a激活策略，该策略不通过对酸性微环境单一性响应来实现对CRISPR/Cas13a系统的释放。过表达的活性氧(ROS)，特别是过氧化氢(H₂O₂)是肿瘤的另一个特征，它不仅在肿瘤的发生中起着独特的作用，而且还影响细胞DNA突变和肿瘤的进展。pHe和H₂O₂的结合可以有效地区分肿瘤组织和正常组织。因此，响应pHe和H₂O₂浓度释放有效载荷的载体在CRISPR/Cas13a系统的递送中应该是理想的，这将为CRISPR/Cas13a的激活提供空前的控制。

发明内容

本发明目的是解决CRISPR/Cas13a系统临床应用过程中所伴随的严重毒副作用的问题，提供一种可限制激活CRISPR/Cas13a系统的双锁纳米粒子(DLNP)的制备方法和应用。