[发明专利]一种检测非粘液型肺炎克雷伯菌毒力的方法

权利要求书

1.一种检测非粘液型肺炎克雷伯菌毒力的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：将待检测的非粘液型肺炎克雷伯菌接种于培养基中，培养，取OD600nm为0.6～0.8的培养液为待检测的非粘液型肺炎克雷伯菌样品；

S2：分别取PCR反应液、上游引物、下游引物、阳性对照、阴性对照、经步骤S1所得的待检测的非粘液型肺炎克雷伯菌样品及灭菌水，进行PCR扩增体系配制，其中，

所述上游引物序列为5’- AACAGGCGGCTGAACATACA-3’，所述下游引物序列为5’-TTTACCCTGCTGCGCTCATT-3’；

所述阳性对照为经全基因组测序确定含有标志物ampR基因且动物实验呈高致死率的非粘液型肺炎克雷伯菌核酸；所述阴性对照为经全基因组测序确定不含有标志物ampR基因且动物实验呈非致死性的非粘液型肺炎克雷伯菌核酸；

所述标志物ampR基因序列如SEQ ID NO.1所示；

S3：将经步骤S2所得的PCR扩增体系分别在转速为3000rpm的条件下，离心30s，再放置于PCR仪中扩增；

S4：将经步骤S3扩增反应后的产物分别进行电泳，观测182bp处对应是否出现条带，并作结果分析。

2.根据权利要求1所述的检测非粘液型肺炎克雷伯菌毒力的方法，其特征在于，在PCR扩增体系中，所述PCR反应液包括浓度为5U/μL Taq聚合酶、浓度为200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为20mmol/L氯化镁溶液、浓度为500mmol/L氯化钾溶液、体积比为0.2%曲拉通溶液、体积比为10%甲酰胺溶液以及浓度为10mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸。

3.根据权利要求1所述的检测非粘液型肺炎克雷伯菌毒力的方法，其特征在于，在PCR扩增体系中，所述上游引物及下游引物浓度均为0.5μmol/L。

4.根据权利要求1所述的检测非粘液型肺炎克雷伯菌毒力的方法，其特征在于，在PCR扩增体系配制中，取至少四个PCR管，并分别编号为阳性对照管、阴性对照管、实验管及空白对照管；其中，

阳性对照管中加入17μL PCR反应液、1μL上游引物、1μL下游引物及1μL阳性对照；

阴性对照管中加入17μL PCR反应液、1μL上游引物、1μL下游引物及1μL阴性对照；

实验管中加入17μL PCR反应液、1μL上游引物、1μL下游引物及1μL经步骤S1所得的待检测的非粘液型肺炎克雷伯菌样品；

空白对照管中加入17μL PCR反应液、1μL上游引物、1μL下游引物及1μL灭菌水。

5.根据权利要求1所述的检测非粘液型肺炎克雷伯菌毒力的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述扩增反应的条件为：

在94℃条件下反应3min；然后35个循环，其中，包括依次在94℃条件下反应30s，在60℃条件下反应30s，在72℃条件下反应30s；最后，在72℃条件下反应5min，然后在4℃条件下保持。