[发明专利]一种基于仿贻贝化学构建电化学免疫传感器的制备方法

权利要求书

1.一种基于仿贻贝化学构建电化学免疫传感器的制备方法，并将其构建电化学免疫传感器的方法，其特征步骤如下：

（1）利用用仿贻贝化学和表面引发原子转移自由基聚合技术设计纳米复合探针：

首先利用仿贻贝化学改性多壁碳纳米管：将多壁碳纳米管（MWCNTs）溶于乙醇和蒸馏水的混合溶液中超声分散，然后在磁力搅拌下加入盐酸多巴胺（DA），搅拌一段时间后，将Tris缓冲液逐滴加入到反应体系中反应，最后，用乙醇和蒸馏水洗净离心分离得到产物MWCNTs@PDA，

将上述所得的MWCNTs@PDA分散于无水二氯甲烷（DCM）中超声，然后加入4-二甲基氨基吡啶（DMAP）和溴苯乙酸（BPA），在冰浴搅拌下，二环己基碳二亚胺（DCC）溶解到DCM中，用恒压滴液漏斗逐滴加入到圆底烧瓶中，反应体系的温度逐渐升高至室温，反应一定时间之后，通过离心洗涤收集产物MWCNTs@PDA-Br，

所述反应溶剂：无水二氯甲烷，酯化反应催化剂：4-二甲基氨基吡啶，

反应中的失水剂：二环己基碳二亚胺，所述反应温度：15~35摄氏度，

所述反应时间：4-24小时；

其次，利用表面引发PET-ATRP技术在MWCNTs@PDA-Br表面接枝功能聚合物刷，在支口瓶中制备由甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA），MWCNTs@PDA-Br，曙红Y（EY），三乙胺（TEA），α-溴苯乙酸乙酯（EBPA）和N,N-二甲基甲酰胺（DMF）组成的反应混合物，通过给反应物充N₂以达到不含氧的N₂气氛，然后将混合物转移到含有LED柔性条带的磁力驱动搅拌装置中，反应需在室温下过夜进行，将反应完成的混合物溶解在DMF中，沉淀至大量的甲醇溶液中，离心收集后进行透析处理，然后冷冻干燥得到产物MWCNTs@PDA-PGMA，

所述PET-ATRP引发剂为：MWCNTs@PDA-Br，所述光催化剂为：曙红Y，

单体：甲基丙烯酸缩水甘油酯，牺牲引发剂：α-溴苯乙酸乙酯，

还原剂：三乙胺，溶剂：N，N-二甲基甲酰胺；

最后，利用所得的MWCNTs@PDA-PGMA制备功能化纳米复合探针，对MWCNTs@PDA-PGMA功能性聚合物刷进行乙二胺（EDA）改性，将功能性PGMA聚合物刷置于含有EDA的烧瓶中，搅拌一段时间后离心洗涤，得到最终的产物，

其中，所述反应温度：50~55摄氏度，

所述反应时间：24小时，

之后，对其接枝两种信号分子蒽醌-2-羧酸和甲酸二茂铁，首先将信号分子置于磷酸盐缓冲溶液中充分分散，加入二环己基碳二亚胺（DCC）/4-二甲基氨基吡啶（DMAP）活化试剂来活化信号分子的羧基，室温下反应，然后与乙二胺改性的聚合物刷混合，室温反应24小时，后离心处理并冻干制成纳米探针，

其中，所述反应温度：20-30摄氏度，羧基的催化试剂：4-二甲基氨基吡啶（DMAP），脱水缩合剂：二环己基碳二亚胺（DCC），溶剂：磷酸盐缓冲溶液；

（2）将（1）得到的纳米复合探针（MWCNTs@PDA-PGMA-Aq/Fc）将与癌胚抗原（CEA）和甲胎蛋白（AFP）的抗体2在一定温度下震荡箱中反应2小时，然后将玻碳电极打磨，经抗体1（CEA+AFP）、牛血清蛋白（BSA）、抗原（CEA+AFP）、复合探针组装后，进行电化学测试，利用上述方法制备功能化纳米复合探针应用于免疫传感器实现肿瘤标志物CEA和AFP的超灵敏检测，对肿瘤标志物检测实现信号的指数级放大，

其中所述BSA浓度：百分之零~百分之二，CEA抗原浓度:163飞克/毫升~163纳克/毫升，AFP抗原浓度：100飞克/毫升~100纳克/毫升。

2.应用上述制备工艺制得的聚合物刷基纳米复合探针。