[发明专利]一种无扫描高超分辨光学三维显微成像方法

说明书

本发明属于光学显微成像技术领域，涉及的是一种无扫描高超分辨光学三维显微成像方法，是一种利用无衍射光束的自弯曲传播效应实现高分辨率、无需机械扫描的三维体成像的方法。将倒置荧光显微镜系统的像面处形成样品的放大像，经第一透镜、反射式或透射式空间光调制器、第二透镜，由CCD相机成像，然后利用空间光调制器产生变化的调制图案，从而得到一系列的投影图像，利用重建算法将这些投影图像进行重建，从而得到原物的三维体结构信息。本发明能够实现无扫描高超分辨率三维显微成像，成像速度较快。

技术领域

本发明属于光学显微成像技术领域，具体涉及的是一种无扫描高超分辨率三维显微成像方法。

背景技术

光学显微镜是一种精密仪器，已有300多年的历史，它具有非接触、低毒性的特点，非常适用于活体生物组织和细胞的成像。为了在生物组织内获得高对比度、清晰的图像，荧光显微技术成为光学显微镜发展的重要分支，成为生物高超分辨显微技术领域的主要研究方向。荧光显微技术的发展，一直追求三个方面的性能提升：分辨率、成像速度(动态成像)和成像景深(体成像)。在成像分辨率方面，远场光学成像受到阿贝衍射极限理论限制，传统最大横向分辨率约为光波长的一半。为了突破限制，目前主要发展了三类技术：1)单分子定位显微技术，如随机光学重建显微技术(STORM)和光激活定位显微技术(PALM)。此类技术结合单分子荧光激发、数据处理与重建获得超分辨图像，但图像重建时间长，难以实现实时成像和三维成像。(2)受激辐射损耗显微技术(STED)。该技术结合光激发与光损耗，可以实现高分辨率的成像，但实时性和三维成像性能较弱。(3)结构光照明显微技术(SIM)。该技术基于频域信息处理方法，分辨率较高，但实时性较低，三维成像能力较差。在成像速度方面，随着分辨率提高，数据处理量增大，导致成像速度降低，因此要求在器件性能和后续数据算法方面突破。在三维信息获取方面，目前主要基于z扫描模式，需要机械移动样品或物镜沿z轴移动，进一步影响成像速度。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的是提供一种无扫描高超分辨率三维显微成像方法，本方法是一种无需机械扫描即可实现一定深度的高超分辨三维显微成像方法，该方法适用于荧光显微成像，以及结构透明、可自发光样本的显微成像系统。

本发明所采用的技术如下：一种无扫描高超分辨光学三维显微成像方法，如下：

(1)光路结构

将样品在倒置荧光显微镜系统的像面形成的放大像，经第一透镜、反射式或透射式空间光调制器、第二透镜，由CCD相机成像，其中，第一透镜和第二透镜相同，光阑与第一透镜、第一透镜与空间光调制器、空间光调制器与第二透镜、第二透镜与CCD相机之间的距离均为第一透镜的焦距f；

(2)光场调制图样设计

(2.1)在空间光调制器上产生主图案，所用的公式为：

K(x,y)＝exp{iβ[(x+y)³+(x-y)³]}

公式中，x,y为平面坐标，x,y的范围由空间光调制器的像素数决定，β为调制系数，根据成像深度不同β取值为(0，1)区间；

(2.2)用阶跃光栅图案覆盖空间光调制器图案的两侧部分，形成带状中心主图案；

(2.3)按整数间隔旋转中心带状图案一周360°，每旋转一个角度，在CCD相机上采集一幅图像，形成供图像重建使用的投影图像序列；

(3)图像重建

对不同的调制图像得到的CCD投影图像进行数据重建，从而得到原物的三维图像，其重建步骤如下：

(3.1)对各CCD投影图像进行拉东变换，并定义一个统一的坐标系(u,v,w)，所依据的公式为：