[发明专利]还原胺化酶、编码基因、重组载体、重组细胞及其应用

说明书

本发明公开了一种还原胺化酶、编码基因、重组载体、重组细胞及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的还原胺化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有还原胺化酶活性的氨基酸序列。本发明重组表达的可溶性SsRA酶具有表达水平高、酶活力高等优点，可用于高效制备(S)‑(4’‑氯苯基)‑(吡啶‑2’‑基)‑甲胺等目前生物催化难以制备的手性双芳基仲胺，经济性高，制备方法简单，反应条件温和，低耗能，对环境友好，副反应少，只需一步还原即可完成。

技术领域

本发明涉及一种还原胺化酶、编码基因、重组载体、重组细胞及其应用， 属于生物工程技术领域。

背景技术

手性仲胺是一类非常重要的化合物，市售的药物中有40％含有手性仲胺基 团。由于手性双芳基仲胺具有两个芳基，可以衍生获得更多具有药用价值的结 构，其中手性(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲胺(CPMAm)可用于合成抗过敏药贝 托斯汀。目前，贝托斯汀的合成主要通过(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，主要包 括以下合成工艺：

(1)化学法：以(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮(CPMK)为原料， (S)-[Ru(BINAP)Cl₂]₂(NEt₃)为催化剂，加压，通氢气，还原得到(S)-(4-氯苯基)-(吡 啶-2-基)-甲醇((S)-CPMA)(赵志全等.中国医药工业杂志.2006.37,726-727)。 以手性BINAL-H为手性还原剂，定向合成单一构型(S)-CPMA。

(2)生物法：2007年，Truppo等筛选发现KRED124可以不对称还原CPMK 生成(R)-CPMA，ee值为94％(Org.Lett.,2007,9,335–338)；2009年，朱敦明 等发现来源于Sporobolomyces salmonicolor的重组羰基还原酶SsCR不对称还原 CPMK生成(R)-CPMA，ee值为88％(Org.Lett.,2008,10,525–528)；2016年， 淮阴师范大学许家兴等发现Cryptococcus sp.在10％[C₂mim][(MeO)HPO₂]存在 时，产物(S)-CPMA的ee最高可达99％(Chem.Eng.J.,2017,316,919-927)； 2018年，本实验室对前期筛选得到的醇脱氢酶进行了分子改造，使其还原CPMK 的立体选择性提高至99.5％(R)及反转至97.8(S)，并在500mM水平进行 了高效不对称还原(J.Am.Chem.Soc.,2018,140,12645-12654)。

上述合成方法中，化学法所需贵金属配位体成本较高、反应条件苛刻，生 物法存在立体选择性不足、催化效率一般等瓶颈问题，并且均需要将羟基进一 步经胺基衍生化获得带有手性胺的终产品。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种还原胺化酶，可催化CPMK的 不对称还原胺化合成手性CPMAm，实现一步法由前手性酮底物合成手性 双芳基胺。本发明提供了一种具有优异的不对称还原胺化活性、底物谱广、 胺基供体范围宽、对环境友好的还原胺化酶及其编码基因，以及含有该基 因的重组表达载体和重组表达转化体，重组酶的制备方法，以及该重组酶 在制备手性双芳基仲胺化合物中的应用。

本发明的第一个目的是提供一种还原胺化酶(SsRA)，所述的还原胺化酶 的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过取 代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有还原胺化酶活性的氨基酸序列。

进一步地，本发明所述还原胺化酶的制备方法为本领域常规制备方法。所 述制备方法较佳地为：将编码所述还原胺化酶并且带有点突变的核酸分子克隆 到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过 培养所得重组表达转化体，经镍柱亲和层析分离纯化获得所述蛋白质。