[发明专利]长链非编码RNA Gas-5调控miRNA-196a的机制及其应用

说明书

本发明涉及医学诊断技术领域，公开了长链非编码RNA Gas‑5调控miRNA‑196a的机制，还公开了长链非编码RNA Gas‑5调控miRNA‑196a的机制在诊断及治疗食管癌的试剂盒及芯片中的应用。本发明以食管鳞状细胞癌为模型，研发出了长链非编码RNA Gas‑5调控miRNA‑196a的具体机制，明确了pri‑miRNA‑196a上与长链非编码RNA Gas‑5的结合位点以及该结合位点干扰miRNA‑196a生成的机制，同时明确了长链非编码RNA Gas‑5上与DGCR8蛋白的多个结合位点以及这些结合位点干扰miRNA‑196a生成的机制，本发明提供的结合位点、结合关系以及竞争关系可用于制备诊断以及治疗食管癌的试剂盒及芯片，为诊断和治疗食管癌开辟新的途径。

技术领域

本发明涉及医学诊断技术领域，具体涉及长链非编码RNA Gas-5调控miRNA-196a的机制及其应用。

背景技术

食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。其发病率和死亡率各国差异很大。我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人。男多于女，发病年龄多在40岁以上。食管癌典型的症状为进行性咽下困难，先是难咽干的食物，继而是半流质食物，最后水和唾液也不能咽下。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们并不编码蛋白质，而是以RNA的形式在多种层面上调控基因的表达。虽然近年来关于lncRNA的研究进展迅猛，但是绝大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的，对lncRNA新功能的挖掘也成为现今非编码RNA研究的热点之一。长链非编码RNAGas-5是1998年在生长抑制的鼠NIH3T3纤维原细胞中呈高表达而被发现的，在人体中，长链非编码RNAGas-5位于非编码染色体区1q25.1，为一个剪切的、多聚腺苷化的非蛋白编码RNA，长链非编码RNAGas-5在多种肿瘤中表达异常，但其在食管癌中的表达及作用还尚未见报道。

miRNA是一类长约22nt的小分子非编码RNA，miRNA基因通常是在细胞核内由RNA聚合酶II(polII)转录生成，最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA，pri-miRNA在核酸酶Drosha酶的作用下被剪切成约70个核苷酸组成的pre-miRNA，然后由ran-GTP和Exportin-5将pre-miRNA输送到细胞质中，随后，另一个核酸酶Dicer酶将其剪切产生约为22个核苷酸长度的miRNA:miRNA*双链。这种双链很快被引导进入沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)中，其中一条成熟的单链miRNA保留在这一复合体中。miRNA-196a位于12号染色体，是Hox家族的上游基因，可以调控HOXA9、HOXB7、HOXC8等基因的表达，在脊椎动物的发育过程中起着非常重要的作用；最近的研究表明miRNA-196a基因的异常表达与多种疾病相关，在正常食管粘膜到食管腺癌的发展过程中，miRNA-196a的表达呈现逐渐增高的趋势。

目前的研究显示pre-miRNA主要是由胞核中名为“微处理器复合体(Microprocessor complex)”(Drosha、DGCR8、p68、p72等蛋白)的蛋白剪切pri-miRNA而生成，然后由Exportin-5及ran-GTP将其转运出核，免遭在核中被降解。Drosha蛋白是一种核蛋白，它由富含脯氨酸的区域以及富含精氨酸和丝氨酸的区域组成的N末端和两个RNaseIII结构域和一个dsRBD结构域组成，Drosha蛋白必须在DGCR8蛋白的辅助下才能特异性地切割pri-miRNA分子。DGCR8蛋白能够与pri-miRNA分子中形成发夹结构的碱基结合，帮助Drosha蛋白定位到酶切位点处，即pri-miRNA分子茎部距离位于双链茎部和侧翼ssRNA序列之间的连接部位的11bp处。