[发明专利]一种检测降钙素原的荧光免疫层析试纸及其制备方法

权利要求书

1.一种检测降钙素原的荧光免疫层析试纸，包括PVC底板；其特征在于：所述PVC底板上从左到右依次设有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫；所述样品垫设置在所述PVC底板的最左端，所述样品垫的一端固定在所述PVC底板上，所述样品垫的另一端搭设在所述结合垫上，所述样品垫的中心处设有样品滴入孔；所述结合垫的一端固定在所述PVC底板上，并位于所述样品垫另一端的下方，所述结合垫的另一端搭设在所述硝酸纤维素膜上；所述结合垫中含有复数个时间分辨免疫荧光微球；所述时间分辨免疫荧光微球的表面修饰有与蛋白或抗体共价耦连的羧基基团；所述硝酸纤维素膜上从左到右依次设有检测线和质控线，所述检测线和所述质控线在所述硝酸纤维素膜上平行相距设置；所述检测线为PCT多抗的划线，其浓度为1.5mg/ml；所述质控线为羊抗鼠IgG抗体划线,其浓度为1mg/ml；所述吸水垫设置在所述PVC底板的最右端，所述吸水垫的左端搭设在所述硝酸纤维素膜上。

2.根据权利要求1所述的检测降钙素原的荧光免疫层析试纸，其特征在于：每个所述时间分辨免疫荧光微球中包裹有荧光物质，所述荧光物质为稀土铕离子配合物，其激发光波长为365nm，反射光波长为610nm，所述时间分辨免疫荧光微球的直径为200nm。

3.根据权利要求1所述的检测降钙素原的荧光免疫层析试纸，其特征在于：所述硝酸纤维素膜为硝酸纤维膜，所述硝酸纤维素膜为表面平整的白色或乳色膜，且所述硝酸纤维素膜的含水量在25％-50％之间，所述硝酸纤维素膜的膜孔径为8μm。

4.根据权利要求1所述的检测降钙素原的荧光免疫层析试纸，其特征在于：还包括塑料外壳，所述塑料外壳包括塑料上壳和塑料下壳；所述荧光免疫层析试纸装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中，所述塑料上壳上设有加样孔和观察窗，所述加样孔对应于试纸条上的样品垫设置，所述观察窗对应于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线设置。

5.一种根据权利要求1所述的检测降钙素原的荧光免疫层析试纸的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：

(1)时间分辨免疫荧光微球的预处理

将时间分辨免疫荧光微球用超声分散处理5min后，取50ul，14000rpm高速离心15min后去除上清液，沉淀物用190ul 10mmol/L，pH6.0的MES缓冲液洗涤；分别配备20mg/ml的碳二亚胺和琥珀酰亚胺，各加入5ul，室温反应30min后，14000rpm高速离心15min，沉淀物用pH为6.0的MES溶液洗涤并重悬至500ul，获得时间分辨免疫荧光微球溶液；

(2)结合PCT单克隆抗体的时间分辨免疫荧光微球的制备

将步骤(1)中处理后的时间分辨免疫荧光微球溶液中加入50ug PCT单克隆抗体，混匀，室温反应2小时，用4％的BSA室温封闭2小时后，14000rpm高速离心15min，用含0.1％BSA、0.2％Tween20、0.1％NaN₃的50mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl保存液洗涤并重悬至100ul，于4℃避光保存，获得结合PCT单克隆抗体的时间分辨免疫荧光微球溶液；

(3)喷金与划膜的处理

用含有1％蔗糖的10mmol/LPBS缓冲液分别稀释羊抗鸡IgG和小鼠抗人PCT单克隆抗体至浓度1mg/ml，取步骤(2)中获得的结合PCT单克隆抗体的时间分辨免疫荧光微球溶液100ul，14000rpm高速离心15min；用250ul含0.5BSA、0.3％Tween20、10％蔗糖的50mmol/L、pH为7.5的Tris-HCl微球重悬液重悬；用喷金划膜仪以1ul/cm的量在所述硝酸纤维素膜上平行喷涂控制线和检测线，所述控制线和检测线之间间隔4mm，用喷金划膜仪以2ul/cm的量在硝酸纤维素膜上平行喷涂时间分辨免疫荧光微球线，与所述检测线间隔4mm；放入37℃烘箱避光烘干10小时，加入干燥剂封存备用；

(4)试纸条的组装

在PVC底板上依次相互交错2mm搭接粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中检测线靠近结合垫，质控线靠近吸水垫，从而得到试纸板，再将试纸板切割成4mm的试纸条；再将试纸条组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳上设有加样孔和观察窗，所述加样孔对应于试纸条上的样品垫，所述观察窗对应于试纸条上的检测线和质控线设置。

6.根据权利要求5所述的检测降钙素原的荧光免疫层析试纸的制备方法，其特征在于：所述PVC底板的尺寸为80*300mm；所述样品垫为全血滤垫，其尺寸为30*300mm，玻璃纤维棉材质；所述硝酸纤维素膜尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质；所述吸水垫尺寸为28*300mm。