[发明专利]一种脑肿瘤实体瘤原代细胞的培养方法

权利要求书

1.一种培养脑肿瘤实体瘤原代细胞的方法，包括如下步骤：利用脑肿瘤实体瘤原代细胞培养基悬浮培养脑肿瘤实体瘤原代细胞；

所述脑肿瘤实体瘤原代细胞培养基由抗菌抗真菌剂三抗、HEPES、GlutaMax、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白MSP、人重组蛋白VEGF、人重组蛋白GDNF、A83-01、N-乙酰-L-半胱氨酸、N-2 Supplement、SB431542、Y-27632、CHIR99021和Advanced DMEM/F12培养基组成；其中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100-200U/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度为100-200µg/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素 B的终浓度为250ng/mL；所述HEPES的终浓度为8-12mM；所述GlutaMax的终浓度为0.8-1.2%体积百分含量；所述人重组蛋白bFGF的终浓度为30 ng/mL；所述人重组蛋白HGF的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白MSP的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白VEGF的终浓度为40 ng/mL；所述人重组蛋白GDNF的终浓度为100 ng/mL；所述A83-01的终浓度为1μM；所述N-乙酰-L-半胱氨酸的终浓度为1mM；所述N-2 Supplement的终浓度为1%体积百分含量；所述SB431542的终浓度为2μM；所述Y-27632的终浓度为10 μM；所述CHIR99021的终浓度为4μM；余量均为Advanced DMEM/F12培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述脑肿瘤实体瘤原代细胞是用样本解离液对脑肿瘤实体瘤组织进行解离处理后获得的；

所述样本解离液由胶原酶I、胶原酶IV和PBS组成；其中，所述胶原酶I在所述样本解离液中的终浓度为150-250 U/mL；所述胶原酶IV在所述样本解离液中的终浓度为150-250 U/mL；余量均为PBS。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：是按照包括如下步骤的方法用所述样本解离液对所述脑肿瘤实体瘤组织进行解离的：按0.1-0.3 mL所述样本解离液每mg组织的用量，将剪碎后的所述脑肿瘤实体瘤组织用事先37 ℃预热的所述样本解离液进行处理，在37℃条件下进行样本解离，解离时间15分钟至3小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，是按照包括如下步骤的方法用所述脑肿瘤实体瘤原代细胞培养基悬浮培养所述脑肿瘤实体瘤原代细胞的：使用细胞培养容器M，利用所述脑肿瘤实体瘤原代细胞培养基悬浮培养所述脑肿瘤实体瘤原代细胞，37℃，5% CO₂条件下进行培养，每2-4天更换一次培养基；

所述细胞培养容器M为如下任一：（I）聚苯乙烯材质的细胞培养容器、聚碳酸酯材质的细胞培养容器、聚甲基丙烯酸甲酯材质的细胞培养容器、COC树脂材质的细胞培养容器或环烯烃聚合物材质的细胞培养容器；（II）对（I）中的细胞培养容器进行CYTOP修饰后的细胞培养容器。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述细胞培养容器为细胞培养皿、细胞培养孔板或用于细胞培养的微孔板芯片。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述（II）中，是按照包括如下步骤的方法对所述（I）中的细胞培养容器进行CYTOP修饰的：对所述（I）中的细胞培养容器进行纯氧刻蚀，刻蚀条件为功率20W，刻蚀时间为3分钟；然后用1% CYTOP溶液覆盖所述细胞培养容器表面，晾干所述1% CYTOP溶液即完成CYTOP修饰。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述1% CYTOP溶液的组成如下：每100mL所述1% CYTOP溶液中含有1mL CYTOP，余量为氟油。