[发明专利]一种用于检测埃博拉病毒的crRNA靶点及CRISPR-Cas13a系统

说明书

本发明公开了一种用于检测埃博拉病毒的crRNA靶点及CRISPR‑Cas13a系统。所述CRISPR‑Cas13a系统包括Cas13a蛋白和crRNA，或二者形成的复合体；所述crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向埃博拉病毒靶点序列的向导序列；所述埃博拉病毒靶点序列位于埃博拉病毒基因组第1001‑1028位。通过实验证明：本发明的crRNA可通过激活Cas13a实现对埃博拉病毒核酸的高灵敏、高特异检测，灵敏度达到单拷贝(1copy/test)。

技术领域

本发明涉及一种用于检测埃博拉病毒的crRNA靶点及CRISPR-Cas13a系统，属于分子诊断技术领域。

背景技术

埃博拉出血热是由埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)引起、导致人类和非人类灵长类动物发生急性感染的烈性传染病，具有致死率高、临床救治能力薄弱、无批准上市的特效药物及无疫苗预防的特点，主要流行于中非、西非地区，其死亡率高达50％～90％。目前埃博拉疫情已经构成了国际关注的突发公共卫生事件，被认为是世界上最凶猛的疾病之一，也是全球公共卫生面临的一大难题。埃博拉病毒的检测技术包括病毒的分离培养、IgM和IgG抗体的检测、荧光定量PCR、恒温核酸检测技术、免疫组化技术等。然而现有检测技术均存在一定的不足，胶体金法简单便携，但灵敏度不足；包括LAMP、RPA在内的恒温扩增法灵敏度很高，但在操作过程中易污染；荧光定量PCR法稳定、可靠、具有一定的灵敏度，但样本处理复杂，且对仪器要求高。

2017年4月，美国研究人员建立了一种灵敏度达到埃摩级(单拷贝)，特异性达到单碱基的核酸检测技术——基于CRISPR-Cas13a的核酸检测平台SHERLOCK(Specific HighSensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)，利用Leptotrichia wadei Cas13a蛋白(LwCas13a)的非特异剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，实现了对痕量核酸快速、廉价、高灵敏的检测。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于检测埃博拉病毒的CRISPR-Cas13a系统。

本发明提供的用于检测埃博拉病毒的CRISPR-Cas13a系统包括Cas13a蛋白和crRNA，或二者形成的复合体；

所述crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向埃博拉病毒靶点序列的向导序列；

所述埃博拉病毒的靶点序列位于埃博拉病毒基因组(GenBank ID：AF086833.2)第1001-1028位。

上述CRISPR-Cas13a系统中，所述埃博拉病毒靶点序列为序列1。

上述CRISPR-Cas13a系统中，所述crRNA序列为序列2。其中，序列2第1-38位为用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列；序列2第39-66位为靶向埃博拉病毒靶点序列的向导序列。

上述CRISPR-Cas13a系统中，所述Cas13a蛋白为LwCas13a蛋白。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测埃博拉病毒的试剂盒。

本发明提供的用于检测埃博拉病毒的试剂盒包括上述用于检测埃博拉病毒的CRISPR-Cas13a系统。

进一步的，所述试剂盒还包括用于特异性扩增埃博拉病毒靶点序列的引物对；所述引物对由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成。