[发明专利]一种数字PCR系统

说明书

本发明提供一种数字PCR系统，该数字PCR系统包括液滴形成组件及液滴喷孔组件，所述液滴形成组件包括导热板及盖板，所述盖板的侧面设有倒U型台阶，所述导热板、所述盖板及所述倒U型台阶共同围成底部开口的液滴形成腔室；所述液滴喷孔组件连接于所述液滴形成组件下方，包括若干液滴喷孔，所述液滴喷孔与所述液滴形成腔室连通，且所述液滴喷孔内设有汽化部件，用于使所述液滴喷孔中的部分数字PCR溶液液体汽化并将剩余所述数字PCR溶液液体快速推入所述液滴形成腔室中的液滴形成油中，以形成数字PCR液滴。本发明使用热泡技术进行高速数字PCR液滴形成，具有高效的数字PCR油利用率，并可进行原位PCR温控及原位数字PCR信号收集。

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其是疾病检测领域，涉及一种一体化原位数字PCR系统及液滴形成方法。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)提出至今已有20年时间，期间PCR已发展成为分子生物学领域的一项关键技术和常规技术，极大地推动了生命科学各个领域的发展。特别是90年代后期，美国ABI公司推出的实时荧光定量PCR(real time PCR，qPCR)技术及相关产品更是将PCR由体外合成及定性/半定量检测技术发展成为一种高灵敏、高特异性和精确定量的基因分析技术。

尽管经过十几年时间的迅速发展，qPCR技术已经用于除外伤和营养缺乏症外所有疾病的诊断，但是，在PCR扩增过程中影响其扩增效率的因素有很多，不能保证在反应过程中扩增效率保持不变和实际样品与标准样品以及不同样品之间的扩增效率是相同的，由此导至其定量分析所依赖的基础——循环阈值(CT)不是恒定不变的。因此qPCR的定量只是“相对定量”，其准确度和重现性依然不能够满足分子生物学定量分析的要求。

20世纪末，Vogelstein等提出数字PCR(digital PCR，dPCR)的概念，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA 模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。与qPCR不同的是，数字PCR不依赖于CT值，因此不受扩增效率影响，扩增结束后通过直接计数或泊松分布公式来计算每个反应单元的平均浓度(含量)，能够将误差控制在5％以内，数字PCR可以不需要对照标准样品和标准曲线来实现绝对定量分析。

数字PCR(也可称单分子PCR)一般包括两部分内容，即PCR扩增和荧光信号分析。在PCR 扩增阶段，与传统技术不同，数字PCR一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应。不同于qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字PCR 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。

由于数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术，相较于qPCR，能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量，因此特别适用于依靠CT值不能很好分辨的应用领域，例如拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。

目前市面上的数字PCR技术主要有三种。一种是通过在特定仪器中使用流动的油切断水相的PCR溶液形成液滴，然后在另外的两台仪器中完成PCR和检测；一种是通过将PCR溶液分布到挖空的硅片上，然后在特定仪器中进行PCR以及另外一台仪器中进行检测；最后一种是在一种仪器上将液体通过狭窄的沟道注入腔体形成液滴，并完成PCR，然后在另一台仪器中完成检测。然而，当前的三种方法的液滴形成速度或者通量各有限制。此外，上述三种技术无一例外的依赖多台大型仪器。这不但增加了仪器的购置的成本，限制了数字PCR的广泛使用；而且增加了实验操作的复杂度。

因此，如何提供一种大于每秒形成1000个液滴的高速的数字PCR液滴形成技术、液滴形成与PCR温控和检测仪器集成的原位PCR技术、高效的数字PCR油利用率方法，成为本领域技术人员亟待解决的一个重要技术问题。