[发明专利]一种蛋白质化学交联剂及其制备方法与应用

说明书

本发明属于蛋白质及其功能研究技术领域，具体涉及一种蛋白质化学交联剂及其制备方法与应用。所述蛋白质化学交联剂，其结构如通式I所示。本发明所述的蛋白质化学交联剂具有反应迅速、不水解的优点，其应用于CXMS技术中展示出高效交联活性，对精氨酸和赖氨酸可以实现特异性识别。本发明所述蛋白质化学交联剂与六个模式蛋白质、十个蛋白混合物、多亚基酵母蛋白复合物、70S核糖体以及外泌体的交联反应证明了这些交联剂与赖氨酸结合的有效性，从而解决了现有交联剂类型不丰富，现有琥珀酰亚胺酯类交联剂在CXMS技术实际过程中存在的诸多问题，如易水解、选择性低以及交联反应较慢等问题。

技术领域

本发明属于蛋白质及其功能研究技术领域，具体涉及一种蛋白质化学交联剂及其制备方法与应用。

背景技术

蛋白质作为生命活动的主要承担者，在生物的生长发育过程中发挥着重要的功能。蛋白质构成的基本单元是氨基酸，氨基酸主链的氨基和羧基彼此相连构成多肽，多肽通过折叠修饰进而形成具有三维结构的蛋白质。蛋白质发挥生理功能依赖于特定的蛋白质三维结构以及蛋白质相互作用网络。因此对蛋白质空间结构以及蛋白质相互作用的研究可以更深入探索蛋白质功能与结构的关系、蛋白质之间相互作用的关联，进一步阐释生命的奥义。

化学交联结合质谱(chemical cross-linking coupled with massspectrometry,CXMS)技术是近些年来迅猛发展的一种检测蛋白质结构和蛋白质相互作用的方法。

CXMS技术对蛋白质样品要求低而灵敏度高，适合对复杂蛋白质样品的分析，而且能够快速地给出相关的信息。由于化学交联剂受到臂长的限制，交联剂在空间舒展的距离范围基本涵盖了蛋白质相互作用的界面，故CXMS技术可以提供蛋白质相互作用界面的信息。另外化学交联剂基于蛋白质的共价交联，客观上实现了蛋白质的结构固定，从而使得研究微弱松散的蛋白质复合物的结构以及相互作用成为可能。该技术不仅可以用于体外蛋白质实验，而且已经有报道利用CXMS技术研究活细胞内蛋白质相互作用网络。

随着质谱仪以及交联数据搜索软件的持续发展，CXMS技术已经获得了长足的进步，但在该技术中能够应用的交联剂存在的主要问题仍未解决：

(1)交联剂类型不丰富。目前商业可购买的交联剂主要是针对蛋白质N端和赖氨酸残基，还有少量针对半胱氨酸残基。但针对其他的活性氨基酸残基，如精氨酸残基、甲硫氨酸残基、酪氨酸残基、组氨酸残基等并没有成熟的交联剂被开发出来。

(2)目前应用最为广泛种类最多的交联剂是氨基类型交联剂，该类交联剂按反应基团分类大体可分为琥珀酰亚胺酯和亚氨酸酯两类。其中由于琥珀酰亚胺酯效果优于亚氨酸酯，琥珀酰亚胺酯占据氨基交联剂的主流。目前使用最为广泛的DSS、BS3、DST等交联剂都是基于琥珀酰亚胺酯设计。

但是由于其易水解、选择性低以及交联反应较慢等问题，导致琥珀酰亚胺酯类交联剂在进行交联实验时常常因为水解而失效，即使能够交联也往往得到数量众多的mono-linked肽段形式。mono-linked肽段形式对蛋白质结构的解析，蛋白质相互作用的理解提供的信息有限，所以琥珀酰亚胺酯类交联剂往往需要较多的用量才能获得足够多inter-linked肽段形式，而加入过多的交联剂本身对蛋白质结构就存在破坏的风险。

此外，由于交联反应速度较慢，难以有效固定微弱松散的蛋白质复合物，使得琥珀酰亚胺酯类交联剂难以用于研究蛋白质微弱的相互作用和结构动态变化。而常规使用的蛋白质复合物固定剂如甲醛、戊二醛等由于其反应选择性差，质谱结果难以分析也难以应用到CXMS技术中。

基于此，开发一类反应迅速、不水解的氨基选择性交联剂是具有广泛应用价值的。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种蛋白质化学交联剂，其具有反应迅速、不水解的优点，应用于CXMS技术中展示出高效交联活性，特别是对精氨酸和赖氨酸可以实现特异性识别。