[发明专利]一种抗逆性花椰菜新品种的培育方法

权利要求书

1.一种抗逆性花椰菜新品种的培育方法，其特征在于：步骤如下：

⑴利用植物组织培养技术，以花椰菜不同组织部位为外植体，在植物激素的诱导下，建立不同来源的愈伤再生体系；

⑵通过改变愈伤组织接种的培养基中激素水平及生长环境条件建立花椰菜松散型胚性愈伤组织诱导体系；

⑶通过在培养基中加入不同质量浓度0.05-0.2％的化学诱变剂EMS或叠氮化钠，将胚性愈伤组织接种到此培养基中进行培养2-10天或直接用采用不同质量浓度0.1-0.3％的化学诱变剂EMS或叠氮化钠处理胚性愈伤组织，从而诱发胚性细胞中染色体组发生变异，并从中筛选出合适的诱变方法，即为采用培养基中加入质量浓度为0.1％EMS处理5天的方法；或者，直接用不同质量浓度0.1-0.3％的EMS或叠氮化钠诱变剂浸泡愈伤组织，根据愈伤的生长情况找到适合的剂量及处理时间，即质量浓度0.2％EMS处理1小时；

⑷使用步骤⑵的方法进行诱导，将诱导出的胚性愈伤组织接种到含有不同植物激素的生长培养基上进行再生芽的诱导，建立高效的再生体系，获得再生培养基；其中，所述不同植物激素为0-0.5mg/LBA和0.1-0.5mg/LIAA；

⑸将步骤⑵诱导出的花椰菜松散型胚性愈伤组织转接到含有不同的筛选压力的培养基上，即不同质量浓度2-10％的PEG的培养基上，进行筛选压力的确定，获得筛选压力的愈伤组织生长培养基；

⑹在经过步骤⑶诱变方法处理后，将花椰菜松散型胚性愈伤组织接种到步骤⑸获得的筛选压力的愈伤组织生长培养基上，进行抗性愈伤组织的筛选；

⑺将筛选出的抗性愈伤组织转接到步骤⑷筛选出的再生培养基上诱导出再生芽，将再生芽继续培养获得再生苗；

⑻将在筛选压力下存活下来的个体植株进一步繁殖及移栽到自然环境下进一步选择培养，获得理想的抗逆性突变体，最终获得花椰菜抗逆性新品种。

2.根据权利要求1所述的抗逆性花椰菜新品种的培育方法，其特征在于：所述步骤⑵中激素水平具体为0.5-3mg/LBA和0.5-4mg/L2,4-D，所述生长环境条件为培养温度20-25℃，1000-2000Lux光照强度。

3.根据权利要求1所述的抗逆性花椰菜新品种的培育方法，其特征在于：所述步骤⑹中：

所述花椰菜松散型胚性愈伤组织在含有0.2％EMS培养基上诱导5d后，在含有8％的PEG-8000的培养基进行培养。

4.根据权利要求1至3任一项所述的抗逆性花椰菜新品种的培育方法，其特征在于：具体步骤如下：

⑴建立花椰菜组培苗快繁体系

取待试花椰菜品种的种子，经过含有2％有效氯的次氯酸钠消毒后接种到1/2MS培养基上，在25℃黑暗条件下经培养获得无菌苗；取无菌苗在含有0.5mg/LBA植物激素的MS培养基上进行增殖培养，培养条件为25℃连续光照，光照强度为2000Lux；经过反复继代培养获得组培苗，待用；

⑵愈伤组织的诱导

取花椰菜无菌苗的叶片、茎段及叶柄，在超净台中用剪刀将其两端造成伤口，放在含有0.5-2mg/L2,4-D激素浓度的MS培养基上进行愈伤组织的诱导，培养条件为25℃连续光照，光照强度为1000Lux；经过30天的诱导，在叶片上的伤口部位产生松软的、生长快速的愈伤组织；

⑶胚性愈伤组织的诱导

将获得的花椰菜愈伤组织在超净台中从外植体上切下，分成大小3mm的小块，将愈伤组织块接种到含有0.5-2mg/LBA和0.5-2mg/L2,4-D的MS培养基中诱导愈伤组织从薄壁细胞向分生细胞转变，从而实现从一般愈伤向胚性愈伤的转变；培养条件为23℃连续光照，光照强度为1000Lux；经过多次继代培养，期间配合显微镜观察，获得结构松散，细胞具有胚性化特征的愈伤组织；

⑷胚性愈伤组织的化学诱变

将胚性愈伤组织切成大小在2-3mm的小块，采用化学诱变剂对其进行处理，处理方法分两种：一是采用质量浓度为0.1-0.3％的EMS化学诱变剂处理愈伤组织，将愈伤块放在诱变剂溶液中，浸泡时间为0.5-2小时，然后将愈伤取出，吸干表面的诱变剂后放在诱导胚性愈伤组织再生的培养基MS上进行再生苗的培养；二是采用在愈伤再生培养基MS中加入浓度为0.5-0.2％EMS的诱变剂，将胚性愈伤块接种到上面，进行培养，培养条件为25℃连续光照，光照强度为2000Lux，通过培养2-8天时间后，根据愈伤组织的成活情况与生长势找到理想的愈伤诱导半致死剂量的诱变剂使用浓度及处理时间；

⑸筛选压力的确定

将诱导出的花椰菜松散型胚性愈伤组织转接到含有不同的筛选压力的愈伤组织再生培养基上MS+30g/L蔗糖，所述筛选压力即浓度为2-10％的PEG，进行筛选压力的确定；培养条件为25℃连续光照，光照强度为2000Lux；观察愈伤组织生长的情况，在高浓度渗透压作用下，愈伤组织会出现生长停止、再生受到抑制和死亡的生理现象的发生，以愈伤组织丧失再生能力和停止生长时的PEG浓度作为筛选的极限，在此基础上适当减少其用量，并最终判断适宜的筛选压力；

⑹抗逆性花椰菜突变愈伤组织的筛选

采用前面步骤获得筛选压力和诱变剂使用方法，进行花椰菜抗逆性突变愈伤组织的筛选，将花椰菜胚性愈伤组织切成3mm小块，接种到含有质量浓度0.1％EMS的愈伤组织生长培养基上，即MS+2mg/LBA+2mg/L2,4-D+30g/L蔗糖，培养5天，培养条件为25℃连续光照，光照强度为2000Lux；再将愈伤组织转接到含有质量浓度4％PEG的MS培养基上进行抗逆性突变芽的筛选，培养条件为25℃连续光照，光照强度为2000Lux，经过30天培养，将获得的再生芽从外植体上剪下，进一步培养；

⑺突变体植株的培养

将经过筛选出的抗性再生苗接种到正常培养条件下进行伸长及生根培养，培养基为MS+0.25mg/LIAA+30g/L蔗糖，培养条件25℃连续光照，光照强度为2000Lux，经过30天培养，将生根苗移栽到盛有基质的花盆中培养成苗；

⑻抗逆性花椰菜植株的移栽及新品种鉴定

将生根的突变植株移栽到花盆中，在温室条件下进行栽培养护，同时对移栽苗进行进一步的生理生化及环境压力方面的检测，以便最终获得抗逆性花椰菜新品种。