[发明专利]一种功能化磷酸钙基因递送系统的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种功能化磷酸钙基因递送系统的制备方法，其特征在于以具有氧化还原响应特性的二硫键连接阿仑膦酸和甘露醇片段得到含有二硫键的甘露醇化阿仑膦酸衍生物，所得含有二硫键的甘露醇化阿仑膦酸衍生物进一步修饰于磷酸钙纳米粒表面并负载基因从而形成稳定的功能化磷酸钙基因递送系统；制备方法具体包括以下步骤：

（1）制备含有二硫键的甘露醇化阿仑膦酸衍生物Man-SS-Aln

① 室温下将1.26 mmol，对应质量为341.6 mg的阿仑膦酸钠溶于10 mL蒸馏水中，使用1 M NaOH水溶液调节pH为8；将1.60 mmol，对应质量为500 mg 的SPDP溶于10 mL乙腈中，分4次加至反应液中，每次加入前用1 M NaOH水溶液调节pH为8，用时2 h；SPDP溶液滴加结束后，在特定温度下搅拌反应一定时间；减压蒸除反应液中的乙腈，加入4倍体积的甲醇，室温下静置过夜后抽滤，真空干燥后得到白色固体SPDP-Aln；

② 室温下将205.58 μmol，对应质量为100.8 mg的SPDP-Aln溶于5 mL蒸馏水中，加入203.64 μmol，对应质量为58.10 mg的Man-Cys，搅拌反应3小时，所述Man-Cys加入方式为：分3次，每次间隔10 min；反应液用300 mL Ⅲ级水快速透析1 h后，冷冻干燥得到白色固体Man-SS-Aln；

（2）基因递送系统制备溶液的配制：溶液a由钙盐和水配制，钙盐浓度为2.5 M；溶液b由磷酸盐、氯化钠、缓冲剂和水配制，磷酸盐浓度为1.5 mM，氯化钠浓度为0.28 mM，缓冲剂浓度为0.05 mM、pH为7.05；溶液c由甘露醇化阿仑膦酸衍生物Man-SS-Aln和水配制，Man-SS-Aln浓度为4.3 μM，

其中Man-Cys的结构式如式（1）、SPDP-Aln的结构式如式（2）、Man-SS-Aln的结构式如式（3）：

（3）将目的基因与溶液a混合，用双蒸水将其稀释为溶液a体积的十倍后，与溶液b等体积混合均匀，再加入与溶液b等体积的溶液c，制备得到负载基因的功能化磷酸钙基因递送系统。

2.根据权利要求1所述的功能化磷酸钙基因递送系统的制备方法，其特征在于：在步骤（2）中，所述溶液a中钙盐为CaCl₂、Ca(NO₃)₂中的一种或两种任意比例的组合；所述溶液b中磷酸盐为Na₃PO₄、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、K₃PO₄、K₂HPO₄、KH₂PO₄、(NH₄)₃PO₄、(NH₄)₂HPO₄的一种或两种以上的任意比例组合；缓冲剂为HEPES、BES、PBS、PIPES、Tris中的一种或两种以上的任意比例组合。

3.根据权利要求1所述的功能化磷酸钙基因递送系统的制备方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述基因为DNA、siRNA、miRNA、lncRNA、circRNA或shRNA中的任一或多种；基因与溶液a混合时的基因质量与溶液a体积的比例为50~5000 μg/mL。

4.一种根据权利要求1制备的功能化磷酸钙基因递送系统在基因转染中的应用。