[发明专利]以多室水凝胶微粒为捕获载体的真菌毒素可视化检测方法

权利要求书

1.以多室水凝胶微粒为捕获载体的真菌毒素可视化检测方法，其特征在于，主要步骤如下：

1)以聚乙二醇200(PEG-200)、丙烯酰胺-聚乙二醇700(PEG-DA 700)、光引发剂1173、丙烯酸、TE缓冲液为原料制备出水凝胶微粒；

2)利用对冲式毛细管微液滴发生装置，以水凝胶预聚液为内相，以二甲基硅油为外相，通过控制注射泵流速，内相管道的数量，制备出不同粒径、不同形状的水凝胶微粒；

3)制备好的水凝胶微粒经EDC活化后与毒素单克隆抗体进行结合反应；

4)将菌毒素标准品与尿素酶经反应后制备成真菌毒素人工抗原；

5)包被有抗体的微粒与人工抗原结合，加入尿素进行酶促反应，然后加入BCP显色液进行颗粒显色。

2.根据权利要求1所述的以多室水凝胶微粒为捕获载体的真菌毒素可视化检测方法，其特征在于，水凝胶微粒的制备具体步骤如下：

(1)1ml注射器每次吸取300-700ul的预聚液，50ml注射器每次吸取二甲基硅油10-40ml；

(2)利用注射泵将预聚液以10-30uL/min的流速泵出，二甲基硅油以1000-3000uL/min泵出，经塑料软管泵出后经紫外灯照射，最终流入50ml离心管中；

(3)回收二甲基硅油，颗粒经双蒸水冲洗2-3遍后装入4ml离心管，并保存于4度冰箱。

3.根据权利要求1所述的以多室水凝胶微粒为捕获载体的真菌毒素可视化检测方法，其特征在于，水凝胶微粒连接毒素单克隆抗体具体步骤如下：

称取水凝胶微粒8-20mg于PBS缓冲液中，称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)4-10mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)8-20mg,活化反应30min后离心清洗3次，500ulPBS重悬，加入4-20ul的0.02mg/ml毒素单克隆抗体，避光反应2小时，加入5％BSA封闭反应过夜。

4.根据权利要求1所述的以多室水凝胶微粒为捕获载体的真菌毒素可视化检测方法，其特征在于，真菌毒素人工抗原的制备步骤如下：

(1)吸取10-100ul真菌毒素标准品溶解于200ul无水乙醇中，加入1.5-15mg EDC室温下避光震荡10min；

(2)称取3-12mg尿素酶溶于1-4ml 0.13mol/L碳酸氢钠溶液中，将1)中活化物加入其中，室温下避光震荡2小时；

(3)产物在0.01mol/L PBS溶液中透析72小时，每隔6-8小时更换一次透析液，透析结束后于-20℃冰箱保存。

5.根据权利要求1所述的以多室水凝胶微粒为捕获载体的真菌毒素可视化检测方法，其特征在于，酶联免疫反应检测真菌毒素的具体步骤如下：

(1)连有毒素抗体的微粒中加入25-100ul的人工抗原37℃孵育1小时，0.128M NaCl洗微粒2-3次；

(2)加入不同浓度梯度(0.001ng/ml-500ng/ml)的真菌毒素标准品37℃下竞争反应20-60min，0.128M NaCl洗微粒2-3次；

(3)加入50-100ul的100ng/ml的尿素，37℃下孵育20-45min，再加入1-20ul的BCP显色液避光显色1-20min，取出微粒置于载玻片上，智能手机进行图片捕获及分析处理。