[发明专利]一种高灵敏和双选择性的CTC检测SPR传感器及其制备方法

权利要求书

1.一种检测CTC的SPR生物传感系统，其特征在于，包括SPR生物传感器、细胞膜功能化的纳米颗粒和叶酸修饰的纳米颗粒，

其中，

所述SPR生物传感器包括表面修饰有JUP抗体的免疫芯片，

所述细胞膜功能化的纳米颗粒含有JUP蛋白和叶酸受体，

所述细胞膜功能化的纳米颗粒通过抗原-抗体的相互作用与所述免疫芯片结合，所述叶酸修饰的纳米颗粒通过叶酸-叶酸受体的相互作用与所述细胞膜功能化的纳米颗粒结合。

2.如权利要求1所述的SPR生物传感系统，其中，所述纳米颗粒为金纳米颗粒、磁纳米颗粒或纳米量子点。

3.如权利要求1所述的SPR生物传感系统，其中，所述细胞膜功能化的纳米颗粒的粒径为40-65nm，所述叶酸修饰的纳米颗粒的粒径为15-30nm。

4.如权利要求1所述的SPR生物传感系统，其中，利用该系统的测定方法包括如下步骤：在表面修饰有JUP抗体的免疫芯片上加入80-100μL 10～10⁵细胞/mL的细胞膜功能化的纳米颗粒，和100-120μL 5-8μM的叶酸修饰的纳米颗粒，以30-45min作为孵育时间，在室温条件下使用SPR仪进行CTC的检测。

5.如权利要求4所述的SPR生物传感系统，其中，所述表面修饰有JUP抗体的免疫芯片按下列方法制备：

(1)将芯片浸没在蛋白连接剂中反应8-12小时，反应结束后将芯片置于甲醇溶液中洗涤1小时，洗涤之后用超纯水轻轻清洗并用氮气吹干芯片表面的水分，

(2)将附着有蛋白连接剂的芯片安装到SPR仪器上，而后，将100μL的0.905μg/mL JUP抗体添加到所述芯片表面上，孵育2小时后，用缓冲液洗涤所述芯片表面以洗脱未连接的JUP抗体，为了避免所述芯片表面上的非特异性吸附，将所述芯片与0.01mg/mL的BSA溶液反应半小时，最终得到表面修饰有JUP抗体的免疫芯片。

6.如权利要求4所述的SPR生物传感系统，其中，所述细胞膜功能化的纳米颗粒按以下方法制备：

(a)获得细胞膜碎片：将消化好的癌细胞或全血以1000rpm的转速离心5分钟，将得到的沉淀复溶在等体积的PBS缓冲液中，然后使用超声波清洁仪器以42kw的频率将溶液超声处理5分钟，超声处理后，将溶液以700g离心10分钟，得到上清液，将所述上清液复溶于等体积的PBS缓冲液中，然后以14,000g离心30分钟，所得的上清液即是所需的细胞膜碎片，

(b)将步骤(a)中获得的上清液与预先配制的纳米颗粒溶液混合，两者溶液的体积比为1：1，然后在高压挤出机上依次通过400nm、200nm和100nm的聚碳酸酯膜，最终得到细胞膜功能化的纳米颗粒。

7.如权利要求6所述的SPR生物传感系统，其中，所述纳米颗粒为金纳米颗粒、磁纳米颗粒或纳米量子点。

8.如权利要求6所述的SPR生物传感系统，其中，所述细胞膜功能化的纳米颗粒的粒径为40-65nm。

9.如权利要求4所述的SPR生物传感系统，其中，所述叶酸修饰的纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：

(i)通过使用0.1M Na₂HPO₄制备叶酸溶液：加入50mM NaOH以将pH调节至7，并加入0.1MNa₂HPO₄直至溶液澄清，产生浓度为约1mM的叶酸溶液,

(ii)通过使用1mM新合成的叶酸溶液进行纳米颗粒的功能化：将1mM叶酸溶液加入到5mL预先合成的纳米颗粒溶液中以获得溶解在5mL纳米颗粒溶液中的12μM的叶酸溶液，并在黑暗中搅拌20分钟，以12,000g离心20分钟后，获得酒红色沉淀，并将其复溶在等体积的PBS缓冲液中，最终得到叶酸修饰的纳米颗粒。

10.如权利要求9所述的SPR生物传感系统，其中，所述纳米颗粒为金纳米颗粒、磁纳米颗粒或纳米量子点，所述叶酸修饰的纳米颗粒的粒径为15-30nm。