[发明专利]一类四环二萜类化合物及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种四环二萜类化合物，其特征在于：所述化合物为含5-5-6-7四环二萜骨架的化合物，其化学分子式为C₂₀H₃₂，结构式如式(1)所示，命名为：委内瑞拉烯A(venezuelaene A)；

2.一种四环二萜类化合物，其特征在于：所述化合物为含5-5-6-7四环二萜骨架的化合物，其化学分子式为C₂₀H₃₀O，结构式如式(2)所示，命名为：委内瑞拉烯B(venezuelaene B)；

3.权利要求1或2所述四环二萜类化合物的制备方法，其特征在于：通过自体沉默基因激活的方法表达委内瑞拉链霉菌Streptomyces venezuelae ATCC 15439中委内瑞拉烯的生物合成基因簇中的基因来获得委内瑞拉烯A或委内瑞拉烯B。

4.权利要求1或2所述四环二萜类化合物的制备方法，其特征在于：通过大肠杆菌中异源表达的方法表达委内瑞拉链霉菌Streptomyces venezuelae ATCC 15439中委内瑞拉烯的生物合成基因簇中的基因来获得委内瑞拉烯A或委内瑞拉烯B。

5.一种权利要求3或4所述的委内瑞拉烯的生物合成基因簇，其特征在于：所述基因簇含有4个基因，分别为编码二萜合酶VenA的基因venA或其功能等同体，编码细胞色素P450酶VenB和VenC的2个基因venB和venC或其功能等同体，编码香叶基香叶基焦磷酸合酶VenD的基因venD或其功能等同体；其中，所述venA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，venB的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，venC的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，venD的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

6.权利要求1所述四环二萜类化合物的制备方法，步骤是：

(1)以S.venezuelae ATCC 15439的基因组为模板，分别以引物VenA-F/VenA-R，VenD-F/VenD-R和pDR4VenC-F/pDR4VenC-R对二萜合酶的基因venA，香叶基香叶基焦磷酸合酶基因venD和细胞色素P450酶基因venC进行PCR扩增，得到基因venA，venD和venC的PCR产物；然后以大肠杆菌表达载体pET28b或其功能等同体为载体构建venA和venD的共表达载体pET28b-venAD；其中，所述引物核苷酸序列分别是：

VenA-F：CCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGCAGCAACGCCTCCGCCCG

VenA-R：GTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGTCAAACCAGCGGTCGGGTGGG

VenD-F：CCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGACCCAGGCGACACTGTC

VenD-R：GTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGTCATCCGTCGCGGTGGCTCA

pDR4VenC-F：CGTGCAGGACTGGGGGAGTTACTAGTATGACCTGGGCCGCTGCGGG

pDR4VenC-R:ATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCTCATGACGCCACCGCCCGGG

(2)将共表达载体pET28b-venAD转化到高产二甲基丙烯基焦磷酸和异戊烯焦磷酸的大肠杆菌工程菌Eco-P即Escherichia coli BL21-DE3/pACYC-mavEmavSpTrc-low化学感受态中，得到能产生委内瑞拉烯A(venezuelaene A)的大肠杆菌工程菌Eco-P/pET28b-venAD；

(3)将大肠杆菌工程菌Eco-P/pET28b-venAD种子液按照体积量1～2:100的比例转接到含卡那霉素、氯霉素和氨苄霉素的TB培养基中于37±2℃，220±20rpm培养，当OD₆₀₀到达1.0-1.5时，加入终浓度为0.1-1.0mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，于18±2℃，220±20rpm的条件下诱导蛋白表达并生物合成委内瑞拉烯A。