[发明专利]D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因、载体、重组细胞以及它们的应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，公开了D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的编码基因、载体、重组细胞以及它们的应用。该编码基因为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或者由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和连接在其上的编码标签序列的核苷酸序列组成。D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明提供了一种新型的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶，其作为D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶，不依赖于金属离子，并且具有较高的热稳定性。此外，本发明提供的基因为经过优化的编码序列，可高效表达D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶，并且得到的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶具有极高的生物安全性，可直接用于工业化生产。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因，含有所述编码基因的重组载体，含有所述重组载体的宿主细胞，所述编码基因、或者所述重组载体、或者所述重组细胞在生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶中的应用，一种生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列在作为D-阿洛酮糖3-差向异构酶中的应用，以及所述编码基因、或者所述重组载体、或者所述重组细胞、或者如SEQID NO：1所示的氨基酸序列在生产D-阿洛酮糖中的应用。

背景技术

随着城市化进程加快、环境污染日益严重、人们生活方式的改变及人口老龄化，肥胖、糖尿病等慢性代谢性疾病的发病率在我国和全球范围急剧上升。而过多食用糖类造成能量过剩是引起肥胖和糖尿病的一个重要原因。如何保持人们习以为常的甜味程度，同时能降低糖在肠道的吸收，减少能量摄入是目前营养和医学界研究的热点之一，同时也是食品行业亟需解决的重要问题。

D-阿洛酮糖(D-psicose)是D-果糖(D-fructose)C-3的差向异构体，其甜度相当于蔗糖的70％，热量相当于蔗糖0.3％(Matsuo,Suzuki et al.2002)，是一种具有特殊保健功能的新型功能性单糖。D-阿洛酮糖具有与蔗糖相近的口感及容积特性，并与蔗糖一样可与食物中的氨基酸或蛋白质发生美拉德反应(Baek,Kwon et al.2008)，可作为食品中蔗糖理想的替代品。动物实验显示，D-阿洛酮糖具有控制2型糖尿病患者血糖的功效，同时对肥胖等相关疾病也一定的预防作用(Hossain,Yamaguchi et al.2015)。动物与人体实验证明，D-阿洛酮糖没有任何不良副作用。2011年8月，美国食品与药物管理局(FDA)确定D-阿洛酮糖为公认安全使用物质(GRAS)，并可作为食品或食品添加剂的组成成分。D-阿洛酮糖在膳食、保健、医药等领域拥有广阔的应用前景。

D-阿洛酮糖极其少量地存在于自然界中，如存在于甘蔗、甜菜糖蜜、小麦和鼠刺属植物，而化学法合成D-阿洛酮糖面临产物纯化步骤复杂、化学污染严重和副产物杂多等问题，目前尚未取得突破性进展。生物转化方法最早由日本香川大学Izumori团队发现(Izumori,Yamakita et al.1990)，其具有反应单一、纯化步骤简单等优点，逐渐成为生产D-阿洛酮糖的主要方法。酮糖3-差向异构酶作为D-阿洛酮糖生物转化的重要催化剂，可催化D-果糖与D-阿洛酮糖之间的相互转化。

目前公开的差向异构酶依赖金属离子(沈雪梅,王靖,张媛,et al.D-阿洛酮糖的功能及其生物合成研究进展[J].生物工程学报,2018,34(09):54-66.)，或转化率偏低(Yueming Zhu,Yan Men,Wei Bai,et al.Overexpression of d-psicose3-epimerasefrom Ruminococcus sp.in Escherichia coli and its potential application in d-psicose production[J].Biotechnology Letters,2012,34(10):1901-1906.)，不利于工业化大规模生产D-阿洛酮糖的成本控制。因此，需要开发不依赖金属离子的优良酮糖3-差相异构酶，以满足工业化生产的需求。

发明内容