[发明专利]一种细胞膜长时间多色荧光成像试剂及其制备方法和用途

说明书

本发明提供了一种细胞膜长时间多色荧光成像试剂及其制备方法和用途。该细胞膜成像试剂通过两步法制备：(1)在聚酰胺‑胺型树枝状高分子(PAMAM)的表面接枝一定数量的聚乙二醇‑胆固醇分子；(2)在第一步得到产物上再接枝不同的荧光分子即得最终的膜成像试剂。该成像试剂制备简单、水分散性和生物相容性良好、成像快速、适用性广泛且成像效果维持时间长。该成像试剂中的荧光分子种类多样，从而能实现不同颜色的细胞膜成像。另外，除了对各种体外培养的哺乳动物细胞具有优异膜成像能力外，该试剂还能对细菌和真菌的细胞膜/壁，以及活体斑马鱼胚胎的表皮细胞的细胞膜进行原位长时间成像。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种细胞膜长时间多色荧光成像试剂及其制备方法和用法。

背景技术

细胞膜有重要的生理功能，它既使细胞维持稳定代谢的胞内环境，又能调节和选择物质进出细胞，保证了细胞内环境的相对稳定，使各种生化反应能够有序运行。细胞膜在功能上与细胞贴壁、迁移、增殖、胞吞、凋亡和信号转导等重要生命活动密切相关。细胞膜状态的变化可以在一定程度上反映细胞内各种生化反应的进程以及细胞活性的变化，因而对细胞膜结构与功能的研究可以获得关于细胞行为和状态的重要信息。细胞膜荧光成像技术是细胞膜研究中最简单和最重要的手段，它不仅可用于直观地观察细胞膜的结构，还可动态追踪其变化从而观察到包括胞吐、胞饮、细胞分裂与凋亡在内的许多重要的生物活动。

目前常用的细胞膜荧光染料(如DiD家族、FM家族和CellMask等)成像效果并不理想，面临着容易被细胞内吞、荧光稳定性不足以及与免疫荧光染色不兼容等诸多问题。其次，目前大多数商品化的细胞膜染料的成像效果不能长时间维持，极易被细胞内吞摄取或从细胞脱落从而无法满足长时间细胞膜染色观察的需要。

另外，目前商品化的膜染料很难实现对细菌和真菌细胞的膜/壁成像。最后，现有的细胞膜染料大多只能实现体外培养细胞的成像，而无法实现体内细胞(如斑马鱼胚胎表皮细胞)的细胞膜成像。综上所述，开发一种长时间成像、成像效果稳定、色彩多样性且能够实现体内层面细胞膜成像的细胞膜荧光探针具有迫切的市场需求。

发明内容

发明目的：为了解决上述问题，本发明提供了一种细胞膜长时间多色荧光成像试剂及其制备方法和用途。该成像探针具有良好的水分散性和生物相容性，能够快速且长时间锚定到细胞膜上实现快速及稳定的细胞膜成像。此外该探针还能实现斑马鱼胚胎表皮细胞细胞膜的长时间多色成像。

技术方案：为了实现上述目的，本发明公开了一种细胞膜长时间多色荧光成像试剂，该成像试剂是通过在聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM的表面共价修饰聚乙二醇-胆固醇分子和荧光染料分子获得。

其中，所述聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM的世代数为第三代、第四代和第五代。所述聚乙二醇-胆固醇分子中聚乙二醇的分子量为500-10000。

优选的，所述聚乙二醇-胆固醇分子的修饰密度为PAMAM末端氨基数量的10％-80％。

所述的荧光染料分子为四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)或吲哚菁类染料。其中，所述吲哚菁类染料选自sulfo-Cy2、sulfo-Cy3、sulfo-Cy5、sulfo-Cy5.5、sulfo-Cy7、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5或Cy7。

本发明还公开了上述细胞膜长时间多色荧光成像试剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取N-羟基琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇-胆固醇和聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)，分别溶解于二甲基亚砜，溶解后混合，室温下反应，反应结束后纯化，冷冻干燥后即可制得成像试剂前体；