[发明专利]一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白、构建方法、表达及应用

权利要求书

1.一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白是将内切纤维素酶EGⅡ与辅助蛋白SwoI或其结构域通过（GGGGS）₂柔性连接肽构建而成，所述内切纤维素酶EGⅡ在N端，辅助蛋白SwoI在C端;

结构域基因序列分别是：Swob，为Expansin-like EG45编码基因；或Swobc，为SwoI去除CBM与Linker区域的编码基因，所述SwoI为去除信号肽后的编码基因序列。

2.根据权利要求1所述的提高木质纤维素水解率的融合蛋白，其特征在于：所述内切纤维素酶EGⅡ来源于里氏木霉QM9414；

或者，所述辅助蛋白SwoⅠ及其结构域来源于里氏木霉，其NCBI基因ID为AJ245918.1。

3.如权利要求1或2所述的融合蛋白的编码基因，其特征在于：所述编码基因的获取方法的步骤如下：

S1. 以里氏木霉QM9414的基因组DNA为模板，以上游引物和下游引物作为扩增引物，所述上游引物和下游引物为SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4、SEQ NO.5、SEQ NO.6，进行PCR扩增，得到Swob、Swobc、SwoI编码基因片段，根据毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，得到优化后的基因；

S2. 通过重叠PCR将进行密码子优化后的内切纤维素酶通过柔性连接肽（GGGGS）₂与密码子优化后的基因，构成融合基因e-b、e-bc、e-s，即为编码基因。

4.包含如权利要求3所述的融合蛋白的编码基因的重组载体，其特征在于：所述重组载体为pPic9k-EB、pPic9k-EBC、pPic9k-ES。

5.如权利要求4所述的重组载体的制备方法，其特征在于：步骤如下：

用EcoRⅠ和NotⅠ分别对pPIC9k载体和e-b、e-bc、e-s基因片段进行双酶切，用T4 DNA连接酶将酶切后的pPIC9k载体和e-b、e-bc、e-s基因片段连接，转化，提取质粒，得到重组载体。

6.包含如权利要求4所述的重组载体的重组毕赤酵母工程菌株，其特征在于：所述工程菌株为GS115-pPic9k-EB 、GS115-pPic9k-EBC、GS115-pPic9k-ES。

7.如权利要求6所述的重组毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于：步骤如下：

S1：用BglⅡ酶对重组载体pPic9k-EB、pPic9k-EBC、pPic9k-ES进行线性化得到线性酶切产物；

S2：以毕赤酵母为宿主菌，将步骤S1得到的线性酶切产物转入，经过抗性筛选阳性克隆子，获得重组毕赤酵母工程菌株GS115-pPic9k-EB、GS115-pPic9k-EBC、GS115-pPic9k-ES。

8.利用如权利要求6所述的重组毕赤酵母工程菌株制备提高木质纤维素水解率的融合蛋白的方法，其特征在于：步骤如下：

S1：将重组毕赤酵母工程菌株接种培养，并诱导其表达；

S2：收获步骤S1的表达产物，并进行纯化得到融合蛋白。

9.如权利要求1或2所述的融合蛋白在降解木质纤维素中的应用。