[发明专利]一种激光显微切割获取抗体标记组织单细胞的方法

说明书

本发明属于生物组织单细胞获取技术领域，公开了一种激光显微切割获取抗体标记组织单细胞的方法。本方法采用低温法处理动物组织，不对动物组织进行固定，在较短时间(0.5‑1小时)内，通过优化的免疫组化法在动物组织原位快速标记识别目标细胞，并结合激光显微切割法切割获得活性目标细胞。本方法可快速、较大量、在组织原位精准获取目标细胞，可用于组织占比较低、细胞体积较大、细胞形态不规则、难以分离培养获得的特殊细胞，获得的细胞所在位置信息清晰，可以较好的保持细胞RNA活性，可用于PCR及要求较高的单细胞测序等研究。

技术领域

本发明涉及生物组织单细胞获取技术领域，尤其涉及一种激光显微切割获取抗体标记组织单细胞的方法。

背景技术

单细胞测序法可以较好地应用于组织中不同细胞的作用机制研究。目前获取单个细胞的方法主要有显微吸取法、流式分选法、显微切割法、微流控分选等。现有的方法大多存在获取细胞较为耗时(三、四个小时以上)、分选中对细胞大小及组织占比等要求限制较多、不能大量精准获取目标细胞、细胞在体位置信息丢失等问题。显微切割技术具有可定位获取细胞的优势，但目前应用于单细胞研究很少，现有的研究报道大多采用固定方式处理组织细胞，切割获得的单细胞主要用于PCR扩增，难以大量获得有效细胞用于单细胞测序。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种激光显微切割获取抗体标记组织单细胞的方法，该方法可以快速、较大量、在原位精准获取目标单细胞。

为解决以上问题，本发明提供了一种激光显微切割获取抗体标记组织单细胞的方法，包括以下步骤：

S1.将动物麻醉后，取目标动物组织置于干冰上速冻，所述目标动物组织中含有目标单细胞；

S2.将所述目标动物组织在冰冻切片机中进行冰冻切片，得到组织切片，将所述组织切片贴于显微切割专用膜片上，得到贴有组织切片的膜片；

S3.根据所述目标单细胞的类型选择携带有荧光标记物的特异性抗体溶液，将所述贴有组织切片的膜片放入干燥盒中低温干燥10分钟，然后放置在0～4℃冰箱中用携带有荧光标记物的特异性抗体溶液孵育10～15分钟对所述组织切片中的目标单细胞进行原位快速标记，然后在0～4℃温度条件下以DEPC水溶液浸泡洗涤1分钟；

S4.将步骤S3处理得到的贴有组织切片的膜片低温干燥后，采用激光显微切割获取目标单细胞，置于裂解液中，快速离心，得到单细胞样本并置于干冰中保存。

优选的，所述组织切片的厚度略大于所述目标单细胞的胞体直径。

优选的，步骤S4中所述采用激光显微切割获取目标单细胞具体为：在明场模式下找到组织，切换到荧光模式定位荧光标记的细胞；利用软件圈出目标细胞，激发激光自动按圈出的形状切割获得目标细胞。

优选的，所述动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述荧光标记物为绿色荧光标记物。

优选的，所述特异性抗体溶液为特异性抗体稀释溶液，所述特异性抗体稀释溶液中特异性抗体与抗体稀释液的体积比为1:50～100。

优选的，所述目标单细胞为动物神经细胞。

本发明还提供了一种上述方法在PCR扩增或者单细胞测序分析中的应用。

与现有技术相比，本方法采用低温法处理动物组织，不对动物组织进行固定，在较短时间(0.5-1小时)内，在动物组织原位通过优化的免疫组化法快速标记识别目标细胞，采用激光显微切割法，可快速、较大量、精准获取目标细胞，可用于组织占比较低、细胞体积较大、细胞形态不规则、难以分离培养获得的特殊细胞(如在脊髓中仅占5％的成年大鼠脊髓前角运动神经元)，获得的单细胞所在位置信息清晰，采用低温法可以较好的保持细胞RNA活性，RNA降解少，可用于PCR扩增及要求较高的单细胞测序研究。

附图说明