[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9转变水稻果皮色的基因编辑方法及其应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cas9转变水稻果皮色的gRNA spacer-Rc1序列，其特征在于，所述gRNA spacer-Rc1的核苷酸序列包括

gRNA-Spacer-Rc1F：5’-GGCAGGGGCGGGAAAGGCGCAAG-3’(SEQ ID NO.1)，和

gRNA-Spacer-Rc1R：5’-AAACCTTGCGCCTTTCCCGCCCC-3’(SEQ ID NO.2)。

2.CRISPR/Cas9-gRNA-spacer表达载体pRGEB32-Rc 1的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

(1)将SEQ ID NO.1所示gRNA-Spacer-Rc1F和SEQ ID NO.2所示gRNA-Spacer-Rc1R退火形成双链；

(2)采用BsaI酶切质粒pRGEB32，连接gRNA spacer-Rc1F和gRNA spacer-Rc1R形成的双链，构建得到表达载体pRGEB32-Rc 1；

(3)使用引物pRGEB32-3对表达载体pRGEB32-Rc 1进行PCR扩增，送测序公司测序验证，如测序结果包括SEQ ID NO.1所示序列，即表示为构建成功的pRGEB32-Rc 1。

3.根据权利要求2所述CRISPR/Cas9-gRNA-spacer表达载体pRGEB32-Rc 1的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述gRNA-Spacer-Rc1F和gRNA-Spacer-Rc1R的退火体系为10μl体系：gRNA-Spacer-Rc1F 1ul(100μM)；gRNA-Spacer-Rc1R 1ul(100μM)；10×T4 DNA连接酶缓冲液1μl(50mMTris-HCl,10mM MgCl₂,10mM DTT,1mM ATP,pH7.5，25℃)；ddH₂0 7μl；将PCR管放于PCR仪，37℃60min，95℃10min，自然冷却至25℃1min，以形成双链。

4.根据权利要求2所述CRISPR/Cas9-gRNA-spacer表达载体pRGEB32-Rc 1的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述引物pRGEB32-3包括：

pRGEB32-3-F：5’-CTGGGTACGTTGGAAACCAC-3’(SEQ ID NO.3),

pRGEB32-3-R：5’-CGGCCCAAATTGAAAAGATA-3’(SEQ ID NO.4)；

所述表达载体pRGEB32-Rc 1的PCR扩增体系为2×PCR Mix 4.0μL,ddH₂O 4.5μL,pRGEB32-3-F(10μmol/L)0.25μL,pRGEB32-3-R(10μmol/L)0.25μL,DNA(10-20ng/μL)1μL,

PCR反应程序为：94℃下预变性5min；94℃下变性45s，55℃下退火45s，72℃下延伸lmin，30个循环；72℃下延伸8min。

5.基于权利要求2至4任一项权利要求所述的构建方法构建得到的CRISPR/Cas9-gRNA-spacer表达载体pRGEB32-Rc 1。