[发明专利]用于鉴定泰国莲种质的SSR分子标记及应用

说明书

本发明属于分子生物学领域，公开了一种用于鉴定泰国莲种质的SSR分子标记及其应用，包括2个分子标记SSR01和SSR02，可准确将泰国莲种质与美洲黄莲、中国莲野生种质区分开来，有效克服表型早期鉴定难以准确区分泰国莲种质与美洲黄莲、中国莲野生种质的缺点，在莲种质资源鉴定、遗传多样性分析上具有十分广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于鉴定泰国莲种质的SSR分子标记及其应用。

背景技术

莲属于莲属莲科的古老孑遗植物，约有1.35亿年的进化历史。全世界仅存两种，亚洲莲(Nelumbonucifera)和美洲莲(N.lutea)。亚洲莲分布较为广泛，北起俄罗斯南部，南到澳大利亚北部，并存在温带、热带两种类型。资源极为丰富，在株型、花型、花色、根状茎、果实及种子等方面表现出极为丰富的遗传多样性。美洲黄莲主要分布于美国，从北部的安大略湖和明尼苏达州至南部的得克萨斯州和东南部的佛罗里达州。其植株较小，地下茎仅前端膨大，叶色深绿，花单瓣黄色，为亚洲莲所缺少的花色。通过与美洲黄莲杂交选育花色更丰富、更艳丽的新品种在莲育种上具有重要意义。

亚洲莲的两种生态型，热带型和温带型，具有明显不同的生长习性。热带型莲主要种植在热带气候(如泰国、印度和中国热带地区)，其生长长年不停顿，地下茎不膨大成藕，而呈鞭状生长。即使引种到亚热带地区，地下茎仍为鞭状，绿叶期长达7个月(5-11月)，花期约5个月(6-10月)。温带型莲广泛种植于中国温带和亚热带地区，有明显的年生长周期，每年清明节前后萌芽生长，6-8月份开花，秋季枯萎凋谢而地下茎膨大成藕，冬季至次年3月份处于休眠状态。热带型莲为改良花期性状提供了宝贵材料，是延长温带型莲花期的最佳亲本选择。

目前莲种质主要是通过外部形态鉴定，但形态特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，仅靠形态差异难以准确鉴定。特别是在莲幼苗期，泰国莲与美洲黄莲、中国野生莲种质间在植物学形态上差异较小，要到花期通过花色与美洲黄莲区分开，到秋季成藕期才能通过地下茎是否膨大成藕进行鉴别。这给利用泰国莲为亲本材料选育长花期莲新品种工作带来了很大的限制，不利于泰国莲种质的高效利用。因此，迫切需要寻找一种真实有效、不受环境影响，能够准确区分泰国莲种质与美洲黄莲、中国野生莲种质中的简单、有效的鉴别技术。

分子标记技术通过检测生物个体在基因组上产生的变异，从而对不同个体进行区分，是继形态标记和生化标记之后，发展的一种较为理想的遗传标记。SSR(简单重复序列)分子标记，是以PCR为基础的DNA多态性检测技术，数量丰富且随机均匀分布于基因组，呈共显性，等位变异高，操作简便且稳定性好，已成为作物种质资源鉴定的一种理想分子标记。该标记可通过比较材料之间的扩增条带，就对同一物种的不同品种进行有效准确的鉴定评价，鉴定结果客观公正、可靠性高，这对泰国莲种质的收集、保存、评价和利用具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于快速、准确鉴定泰国莲种质的SSR分子标记及其应用，可将泰国莲种质与美洲黄莲、中国莲野生种质资源准确区别开，操作简单、重现性好、准确度高。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

申请人收集了不同地理来源、有代表性的92份莲种质资源，包括泰国莲种质25份、美洲黄莲野生种质17份和中国莲野生种质50份，作为实验材料。同时利用生物信息学技术根据千年古莲“中国古代莲”的基因组序列设计了500对SSR引物。以形态学特征差别较大的6个莲种质进行了大量引物的筛选，筛选出36对多态性好、主带清晰的引物。进一步用36对SSR引物对92份莲种质资源进行PCR扩增，从中寻找能区分能够区分泰国莲、美洲黄莲和中国莲野生种质的特异性引物对。最终筛选出2对SSR引物可准确鉴定出泰国莲、美洲黄莲和中国莲野生种质。

用于PCR扩增分子标记SSR01的引物序列为：

正向引物SSR01F：5'-AAGTACCATGTATGCGTCAG-3'和