[发明专利]一种人血浆PTEN基因甲基化检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种人血浆PTEN基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：针对人PTEN基因启动子区中CpG富集位点设计的甲基化特异引物对，以及针对人PTEN基因启动子区-978至-786位置设计的非甲基化特异引物对。

2.根据权利要求1所述的人血浆PTEN基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述甲基化特异引物对的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1所述的人血浆PTEN基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述非甲基化特异引物对的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的人血浆PTEN基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括血浆收集试剂、血浆游离DNA提取试剂、血浆游离DNA的CT转换处理试剂和荧光定量MSP扩增试剂。

5.根据权利要求4所述的人血浆PTEN基因甲基化的检测试剂盒，其特征在于，

所述血浆收集试剂含：抗凝剂；

所述血浆游离DNA提取试，含：裂解液GHH、Proteinase K、Carrier RNA、磁珠、缓冲液、漂洗液、洗脱缓冲液；

所述血浆游离DNA的CT转换处理试剂含：CT Conversion粉剂、M-Dilution Buffer、M-Dissolving Buffer、水、M-Binding buffer、M-Wash Buffer、M-Desulphonation Buffe、HPLC级水；

所述荧光定量MSP扩增试剂含：2×multiplex PCR premix和无菌水。

6.一种如权利要求1-5中任一项所述的人血浆PTEN基因甲基化的检测试剂盒在评估PTEN基因在血浆肿瘤循环DNA中的含量中的应用。

7.一种使用如权利要求1-5中任一项所述的检测试剂盒进行人血浆PTEN基因甲基化检测的方法，其特征在于，

A、将采集的血样进行预处理；

B、将预处理得到的血浆采用磁珠法进行提取获得血浆游离DNA；

C、采用亚硫酸氢盐法将血浆游离DNA进行化学修饰，再进行CT转换处理后重新提取DNA；

D、以步骤C处理后获得的DNA样本为扩增模板，分别以所述甲基化特异引物对和非甲基化特异引物对进行荧光定量MSP检测；

E、以标准品血浆DNA的扩增结果制定外标准曲线，对待测样本进行定量结果分析。

8.根据权利要求7所述的进行人血浆PTEN基因甲基化检测的方法，其特征在于，步骤C中，所述CT转换处理具体包括：

C1、向CT Conversion粉剂中加入水、M-Dilution Buffer和M-Dissolving Buffer，室温振荡充分溶解和混匀，配制得CT Conversion试剂；

C2、将CT Conversion试剂和血浆游离DNA加入PCR管中，振荡、离心后，进行CT转换；CT转换的PCR条件为：98℃10min，64℃2.5h，20℃；

C3、吸取M-Binding buffer于IC柱中，然后将步骤C2获得的CT转换反应产物加入IC柱中，混匀，离心，去废液；

C4、吸取M-Wash Buffer加入IC柱中，离心，弃废液；

C5、吸取M-Desulphonation Buffer加入IC柱中，避光，室温静置20min，离心；

C6、吸取M-Wash Buffer加入IC柱中，离心，弃废液；

C7、再吸取M-Wash Buffer加入IC柱中，离心，然后将IC柱室温干燥；

C8、将IC柱放入水中室温静置，离心，收集，即得重新提取的DNA。