[发明专利]原代乳腺上皮细胞培养基、培养方法及其应用

权利要求书

1.一种用于培养原代乳腺上皮细胞的原代细胞培养基，其特征在于：

含有双向调节素、表皮生长因子、胰岛素、B27、ROCK激酶抑制剂Y27632、神经调节素1、成纤维细胞生长因子7、TGFβI型受体抑制剂A8301和P38/MAPK抑制剂SB202190，且不含血清、牛垂体提取物、Wnt激动剂、R-spondin家族蛋白、BMP抑制剂、成纤维细胞生长因子10、烟酰胺和N-乙酰半胱氨酸，

所述双向调节素的含量为10ng/ml～100ng/ml；

所述表皮生长因子的含量为2.5ng/ml～20ng/ml；

所述胰岛素的含量为1μg/ml～10μg/ml；

所述B27以1:25～1:100的终浓度稀释；

所述Y27632含量为5μM～15μM；

所述神经调节素1的含量为5nM～20nM；

所述成纤维细胞生长因子7的含量为2.5ng/ml～20ng/ml；

所述A8301的含量为100nM～500nM；

所述SB202190的含量为100nM～500nM。

2.如权利要求1所述的原代细胞培养基，其特征在于：

所述原代乳腺上皮细胞为乳腺癌肿瘤细胞、正常乳腺上皮细胞、乳腺上皮干细胞。

3.一种原代乳腺上皮细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制权利要求1或2所述的原代细胞培养基；

(2)用细胞外基质胶稀释液包被培养器皿；

(3)在包被好的培养器皿内接种原代乳腺上皮细胞，使用所述原代细胞培养基，在正常氧气浓度条件或低氧条件下进行培养，在原代乳腺上皮细胞生长至占培养器皿底面积80％～90％左右的细胞密度时进行消化传代。

4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于：

所述细胞外基质胶为低生长因子型，

采用无血清培养基对所述细胞外基质胶进行稀释，所述细胞外基质胶的稀释比例为1:50～1:400，

包被方法为将稀释后的细胞外基质胶加入培养器皿内，使其完全覆盖培养器皿底部，静置包被30分钟以上。

5.一种用于治疗乳腺疾病的药物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)根据权利要求3或4所述的培养方法培养得到乳腺上皮细胞；

(2)选定需要检测的药物；

(3)所述药物以其最大血浆浓度C_max为参考，以2～5倍C_max为起始浓度，稀释成不同的药物浓度梯度；

(4)将步骤(1)培养得到的乳腺上皮细胞消化成单细胞悬液，并用含有细胞外基质胶的权利要求1或2所述的原代细胞培养基将单细胞悬液进行稀释，按每孔1000～10000个细胞的接种密度将稀释后的细胞悬液加入多孔板内，进行过夜贴壁；

(5)对步骤(4)中得到的贴壁细胞添加梯度稀释后的所述药物；

(6)进行细胞活力检测。

6.如权利要求5所述的筛选方法，其特征在于：

所述细胞活力检测中，向每孔加入细胞活力检测试剂，震荡均匀后，用荧光酶标仪测量各孔的化学发光强度值，根据测得的数值绘制药物量-效曲线，计算各个药物对细胞的增殖的抑制强度。