[发明专利]一种检测脑膜炎奈瑟氏菌的环介导等温扩增引物组及检测方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测脑膜炎奈瑟氏菌的环介导等温扩增引物组及检测方法。为了解决现有PCR扩增步骤需要频繁的进行升温和降温过程的缺陷，本发明提供一种检测脑膜炎奈瑟氏菌的环介导等温扩增引物组及检测方法。所述的引物组包括下述引物：外引物Nme2‑F3‑1：SEQ ID NO:1，外引物Nme2‑B3‑1：SEQ ID NO:2，内引物Nme2‑FIP‑1：SEQ ID NO:3，内引物Nme2‑BIP‑1：SEQ ID NO:4，环引物Nme2‑LF‑1 SEQ ID NO:5，环引物Nme2‑LB‑1：SEQ ID NO:6。该环介导等温扩增(LAMP)引物组和检测方法能够特异性、且准确、快速检测脑膜炎奈瑟氏菌。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测脑膜炎奈瑟氏菌的环介导等温扩增引物组及检测方法。该环介导等温扩增(LAMP)引物组和检测方法能够特异性、且准确、快速检测脑膜炎奈瑟氏菌。

背景技术

脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)简称脑膜炎球菌，可引起脑膜炎和其他形式的脑膜炎球菌疾病，如脑膜炎球菌败血症，一种威胁生命的败血症。作为一种专门的人类病原体，它以流行病和地方病的形式在世界范围内发生，主要在非洲和亚洲。它是儿童和年轻成人细菌性脑膜炎的主要原因，在约10％的病例中导致发育障碍和死亡,而且在感染后12小时内死亡风险接近15％。诊断的金标准是通过从无菌体液(可能是CSF或血液)生长而对脑膜炎奈瑟球菌进行微生物分离，但培养周期长，至少需要48-72小时，且经常出现培养失败等情况。

申请号201210137052.4(公布日：2012年8月22日)，发明名称“脑膜炎奈瑟氏菌的特异性检测和鉴别用引物探针组合和试剂盒”，和申请号201110004826.1(公布日：2011年8月17日)，发明名称“一种对脑膜炎奈瑟氏菌的ITS特异的核苷酸及其应用”以PCR原理进行快速筛查。该类方法采用荧光探针，利用一对扩增引物检测样品中的目标核酸序列。但该类方法所用核酸扩增步骤需要频繁的进行升温和降温过程，耗时至少需要1.5h以上，并需要使用到昂贵设备，如荧光定量PCR仪、电泳仪和测序仪等辅助进行结果判断，无法适应简单的实验条件或现场实时检测的需求。

环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isotherm amplification，LAMP)是Notomi T.于2000年开发等温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)和多对特异性引物，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下完成核酸扩增反应。近年来，该技术已逐步应用于病原微生物的检测，如《一种检测甲型副伤寒沙门氏菌的LAMP试剂盒》(中国专利公布号CN 102643901 A，公布日2012年8月22日)，但目前尚未见该方法用于脑膜炎奈瑟氏菌的检测，更无合适高效的引物用于该领域的LAMP检测。

发明内容

为了解决现有PCR扩增步骤需要频繁的进行升温和降温过程的缺陷，本发明提供一种检测脑膜炎奈瑟氏菌的环介导等温扩增引物组及检测方法。发明内容涉及检测脑膜炎奈瑟氏菌的特异性引物组，和利用该引物组建立的检测方法。本发明提供的检测脑膜炎奈瑟氏菌的环介导等温扩增引物组可在等温下扩增，解决了现有PCR扩增步骤需要频繁的进行升温和降温的问题，且灵敏度高、特异性好。进一步的，本发明解决了现有PCR扩增步骤耗时长的问题，本发明提供的引物组及利用该引用组建立的检测方法检测速度快。

本发明提供了一种检测脑膜炎奈瑟氏菌的环介导等温扩增引物组，所述环介导等温扩增引物组包括下列引物：

外引物Nme2-F3-1(简称F3)：5’-TACATCTTTATTCTTCACAGGA-3’(SEQ ID NO:1)，

外引物Nme2-B3-1(简称B3)：5’-AAGATCGCCGTTCTGAT-3’(SEQ ID NO:2)，

内引物Nme2-FIP-1(简称FIP)：