[发明专利]一种基于滚环复制的质粒线性化方法及在感受态转化中的应用

权利要求书

1.一种基于滚环复制的质粒线性化方法，其特征在于，按照下列步骤进行：

步骤一、准备Buffer D1和Buffer N1；

步骤二、加入2.5μl或5μl体积的DNA模板；

步骤三、加入2.5μl或5μl体积的Buffer D1，震荡混匀并短暂离心；在15-25℃条件下静置3分钟；

步骤四、加入5μl或10μl体积的Buffer N1，震荡混匀并短暂离心；

步骤五、准备master mix；

步骤六、加入40μl或30μl的master mix到步骤5中的10μl或20μl体积的变性DNA；

步骤七、30℃反应10-16h；

步骤八、将REPLI-g Mini DNA Polymerase变性，65℃保温3min；

步骤九、将样品1:20在TE中稀释进行PCR分析，每次PCR反应用3μl体积的稀释DNA；4℃保存，-20℃长期保存。

2.一种基于滚环复制的质粒线性化方法在SCK6感受态转化中的应用，其特征在于，按照下列步骤进行：

步骤一、SCK6感受态的制备

(1)接种新鲜的B.subtilis SCK6菌株的单菌落到3ml带有1μg/ml新霉素的LB培养基中；

(2)菌株在37℃，200rpm的条件下培养过夜；

(3)将隔夜培养的培养液使用新鲜的混有浓度为1％(w/v)木糖的LB培养基稀释，至浓度A600＝1，再次培养2小时；

(4)此时的SCK6细胞已处于感受态，使用10％的甘油分装储存至-80℃以备用。

步骤二、转化

(1)在EP管中将1μl经过线性化的质粒与100μl的超级感受态细胞SCK6混匀，在37℃，200rpm的摇床中培养90min；

(2)稀释10³-10⁴倍，在具有适当抗生素的培养基上涂板过夜；

且，在转化步骤中所使用的线性化的质粒为如权利要求1所述的一种基于滚环复制的质粒线性化方法制备得到的质粒。