[发明专利]用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合及其应用

权利要求书

1.一种用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合，其特征在于，包括19组引物对，该19组引物对的序列依次为：如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的第一组引物对，如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的第二组引物对，如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的第三组引物对，如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的第四组引物对，如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的第五组引物对，如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的第六组引物对，如SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14所示的第七组引物对，如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的第八组引物对，如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的第九组引物对，如SEQ ID NO:19和SEQID NO:20所示的第十组引物对，如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的第十一组引物对，如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的第十二组引物对，如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的第十三组引物对，如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的第十四组引物对，如SEQID NO:29和SEQ ID NO:30所示的第十五组引物对，如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示的第十六组引物对，如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的第十七路组引物对，如SEQ IDNO:35和SEQ ID NO:36所示的第十八组引物对和如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的第十九组引物对，其中，后一组引物对中的上游引物与线粒体DNA互补的位置位于前一组引物对的下游引物与线粒体DNA互补位置的上游。

2.如权利要求1所述的用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合，其特征在于，所述19组引物对分别应用于聚合酶链式反应中。

3.如权利要求2所述的用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合，其特征在于，聚合酶链式反应中，鲤鱼样本的模板为鲤鱼总DNA。

4.如权利要求3所述的用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合，其特征在于，所述鲤鱼样本的品种为福瑞鲤、黄河鲤、锦鲤或荷包红鲤。

5.一种利用权利要求1所述的引物组合获取到鲤鱼线粒体DNA序列信息的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)获得待测鲤鱼样本的总DNA；

2)以步骤1)提取的总DNA为模板，分别采用所述引物组合中的引物对进行聚合酶链式反应，获得扩增产物；

3)对扩增产物进行测序，之后据所述扩增结果获得序列信息。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中，进行聚合酶链式反应时，50mL反应体系中包含：DNA聚合酶2个单位，10×聚合酶缓冲液5μL，25mmol/L的MgCl₂ 5μL，10mmol/L的dNTP 1μL，10μmol/L的引物对各2μL，模板DNA 100～1000μg。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中，聚合酶链式反应结束后，将所述扩增产物在666.61-1333.22Pa以下范围的接近真空状态和72℃条件下处理10～20min，然后再至于0～4℃进行保存。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中，获得待测鲤鱼样本的总DNA的具体方法包括如下步骤：

步骤一、剪取鲤鱼的鳍条，保存于无水乙醇中；

步骤二、用STE缓冲液将鳍条泡洗5h以上，去除无水乙醇，然后取约0.2g鳍条、剪碎，加入0.5mL STE缓冲液、10mg/mL的蛋白酶K15和质量体积比10％的SDS 40μL于50℃水浴4～6h，最后去除蛋白得到所述总DNA。

9.如权利要求1所述的用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合于科学研究中的应用。