[发明专利]一种用高效液相色谱法分离测定含多个手性中心的多肽手性异构体的方法

说明书

本发明公开了一种用高效液相色谱法分离测定含多个手性中心的多肽手性异构体的方法，包括以下几个步骤：步骤一，多肽衍生化处理：将含多个手性中心的多肽溶于稀释剂中，依次加入缓冲溶液和衍生化试剂，放置暗处60℃水浴反应60min，获得多肽手性异构体衍生化物；步骤二，分离检测：采用高效液相色谱法对多肽手性异构体衍生化物进行分离和检测。本发明具有快速高效分离检测出含两个及以上手性中心的多肽手性异构体，操作方法简单，分离度高，灵敏度强等优点。

技术领域

本发明涉及多肽分离检测的技术领域，特别是一种用高效液相色谱法分离测定含多个手性中心的多肽手性异构体的方法的技术领域。

背景技术

多肽是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等。通常由三个或三个以上氨基酸分子脱水缩合而成的化合物都可以成为叫多肽。现有的一些多肽含有多个手性中心，如N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，其具有两个手性中心和四种手性异构体，且四种手性异构体分别为D-丙氨酰-D-谷氨酰胺、L-丙氨酰-D-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、D-丙氨酰-L-谷氨酰胺。基于多肽分子结构中没有共轭基团，其在紫外检测器下未有吸收峰，采用常规的氨基柱和手性柱的高效液相色谱法的测定方法难以将多肽手性异构体有效分离。此外，药典检测对成品原料药构型具有要求，因此针对具有手性中心的多肽进行精确检测至关重要。开发一种适用于含两个及以上手性中心以上的多肽手性异构体的分离检测方法，对于定量、定性分析多肽原料药具有较大意义。

发明内容

本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种用高效液相色谱法分离测定含多个手性中心的多肽手性异构体的方法，能够快速高效分离检测出含两个及以上手性中心的多肽手性异构体，操作方法简单，分离度高，灵敏度强。

为实现上述目的，本发明提出了一种用高效液相色谱法分离测定含多个手性中心的多肽手性异构体的方法，包括以下几个步骤：

步骤一，多肽衍生化处理：将含多个手性中心的多肽溶于稀释剂中，依次加入缓冲溶液和衍生化试剂，放置暗处60℃水浴反应60min，获得多肽手性异构体衍生化物；

步骤二，分离检测：采用高效液相色谱法对多肽手性异构体衍生化物进行分离和检测；

其中，所述高效液相色谱法的色谱柱为离子交换型手性柱，流动相由流动相A与流动相B按体积比为(10～25)：(70～95)混合而成，所述的流动相A为甲醇缓冲盐溶液，所述的流动相B为乙腈缓冲盐溶液，所述的高效液相色谱法在高效液相色谱仪下进行检测分析。

作为优选，所述稀释剂为5%甲醇，所述步骤一中的缓冲溶液为硼酸缓冲溶液。

作为优选，所述硼酸缓冲溶液的PH为9.0，且由0.05mol/L硼砂溶液与0.2mol/L硼酸溶液按体积比为4:1混合而成。

作为优选，所述衍生化试剂为2，4-二硝基氟苯。

作为优选，所述甲醇缓冲盐溶液由甲醇、水、甲酸、二乙胺按体积比为980：20：2：2.6混合而成，所述的乙腈缓冲盐溶液由乙腈、水、甲酸、二乙胺按体积比为980：20：2：2.6混合而成。

作为优选，所述流动相A与流动相B的体积比为20:80。

作为优选，所述流动相的PH为5～6，流动相的流速为0.9～1.1ml/min。

作为优选，所述离子交换型手性柱的柱温为30℃，离子交换型手性柱为CHIRALPAKZWIX(+)，离子交换型手性柱的规格为3μm 4.0 x 150mm。

作为优选，所述高效液相色谱仪分析时液相色谱检测波长为355nm。

作为优选，所述高效液相色谱法进行色谱检测时进样量为20μl，所述的洗脱溶液为PH7.0的磷酸缓冲溶液。